Tet2 నష్టం హేమాటోపోయిటిక్ కాండం / పుట్టుకతో వచ్చే కణాలలో హైపర్‌ముటాజెనిసిటీకి దారితీస్తుంది | ప్రకృతి సమాచార మార్పిడి

Tet2 నష్టం హేమాటోపోయిటిక్ కాండం / పుట్టుకతో వచ్చే కణాలలో హైపర్‌ముటాజెనిసిటీకి దారితీస్తుంది | ప్రకృతి సమాచార మార్పిడి

Anonim

విషయము

  • DNA మిథైలేషన్
  • మైలోప్రొలిఫెరేటివ్ వ్యాధి

నైరూప్య

TET2 అనేది 5-మిథైల్సైటోసిన్ ఆక్సీకరణం యొక్క బహుళ దశలను ఉత్ప్రేరకపరిచే ఒక డయాక్సిజనేజ్. TET2 ఉత్పరివర్తనలు తరచూ వివిధ రకాల హేమాటోలాజికల్ ప్రాణాంతకతలలో సంభవిస్తున్నప్పటికీ, ఈ క్యాన్సర్లకు వారు ప్రమాదాన్ని పెంచే విధానం సరిగా అర్థం కాలేదు. Tet2 - / - ఎలుకలు సుదీర్ఘ జాప్యాల తర్వాత ఆకస్మిక మైలోయిడ్, T- మరియు B- సెల్ ప్రాణాంతకతలను అభివృద్ధి చేస్తాయని ఇక్కడ మేము చూపించాము . Tet2 - / - కణితుల యొక్క ఎక్సోమ్ సీక్వెన్సింగ్ APC , Nf1 , Flt3 , Cbl , Notch1 మరియు Mll2 తో సహా అనేక ఉత్పరివర్తనలు పేరుకుపోవడాన్ని తెలుపుతుంది, ఇవి మానవ హేమాటోలాజికల్ ప్రాణాంతకతలలో పునరావృతమవుతాయి / పరివర్తనం చెందుతాయి. వైల్డ్-టైప్ మరియు ప్రీమాలిగ్నెంట్ టెట్ 2 - / - సింగిల్-సెల్-టార్గెటెడ్ సీక్వెన్సింగ్ టెట్ 2 - / - కణాలలో అధిక మ్యుటేషన్ పౌన encies పున్యాలను చూపుతుంది. TET2 సాధారణంగా బంధించే 5-హైడ్రాక్సీమీథైల్సైటోసిన్ పొందిన జన్యుసంబంధమైన ప్రదేశాలలో పెరిగిన పరస్పర భారం ఎక్కువగా ఉందని మేము ఇంకా చూపిస్తాము. ఇంకా, TET2- మ్యూటెడ్ మైలోయిడ్ ప్రాణాంతక రోగులకు అడవి-రకం TET2 ఉన్న రోగుల కంటే చాలా ఎక్కువ పరస్పర సంఘటనలు ఉన్నాయి. అందువల్ల, టెట్ 2 నష్టం హేమాటోపోయిటిక్ స్టెమ్ / ప్రొజెనిటర్ కణాలలో హైపర్‌ముటాజెనిసిటీకి దారితీస్తుంది, ఇది హేమాటోలాజికల్ ప్రాణాంతక పాథోజెనిసిస్ యొక్క నవల TET2 నష్ట-మధ్యవర్తిత్వ విధానాన్ని సూచిస్తుంది.

పరిచయం

పది పదకొండు ట్రాన్స్‌లోకేషన్ మిథైల్సైటోసిన్ డయాక్సిజనేసెస్ (TET1 / 2/3) 5-మిథైల్సైటోసిన్ (5mC) ను 5-హైడ్రాక్సీమీథైల్సైటోసిన్ (5hmC) గా మార్చడానికి ఉత్ప్రేరకపరుస్తుంది మరియు 5hmC ని 5-ఫార్మిల్సైటోసిన్ (5fC) మరియు 5-కార్బాక్సిల్కాటోసిన్ 1 (5fC) 2, 3 . 5fC మరియు 5caC ను బేస్ ఎక్సిషన్ రిపేర్ (BER) 4 యొక్క థైమిన్ DNA గ్లైకోసైలేస్ (TDG) ద్వారా తొలగించవచ్చు. ప్రత్యామ్నాయంగా, 5-హైడ్రాక్సీమీథైలూరాసిల్ (5 హెచ్‌ఎంయు) ను ఉత్పత్తి చేయడానికి AID / APOBEC సైటిడిన్ డీమినేసెస్ చేత 5hmC సైట్లలో డీమినేషన్ సంభవించవచ్చు, దీనిని BER 5 కూడా మరమ్మతులు చేయవచ్చు. అందువల్ల, DNA మిథైలేషన్ మరియు TET లు / TDG-BER- నడిచే DNA డీమెథైలేషన్ డైనమిక్ సైటోసిన్ మార్పుల యొక్క పూర్తి చక్రాన్ని ఏర్పరుస్తుంది. జన్యువులో 5 ఎంసి యొక్క ఆక్సీకరణ మరియు డీమిథైలేషన్ అధునాతన పద్ధతిలో నియంత్రించబడతాయి. టిడిజి మరియు టెట్స్ యొక్క జన్యు క్రియారహితం వివిధ జన్యు నియంత్రణ ప్రాంతాలలో సిపిజి మార్పుల యొక్క ప్రముఖ మార్పులకు దారితీస్తుంది. TET లు / TDG-BER- మధ్యవర్తిత్వ సైటోసిన్ మార్పులు మొత్తం జన్యువు అంతటా విస్తృతంగా వ్యాపించే అవకాశాన్ని ఇది పెంచుతుంది.

TET2 వయోజన మైలోయిడ్ ప్రాణాంతకతలో సాధారణంగా పరివర్తన చెందిన / తొలగించబడిన జన్యువులలో ఒకటి, వీటిలో ∼ 30% మైలోడిస్ప్లాస్టిక్ సిండ్రోమ్ (MDS), 20% మైలోప్రొలిఫెరేటివ్ నియోప్లాజమ్స్ (MPN లు), 17% డి నోవో అక్యూట్ మైలోయిడ్ లుకేమియాస్ (AML లు), 30% ద్వితీయ AML లు మరియు 50-60% దీర్ఘకాలిక మైలోమోనోసైటిక్ లుకేమియాస్ 6, 7, 8, 9 . టి-సెల్ లింఫోమాస్‌లో (యాంజియోఇమ్యునోబ్లాస్టిక్ టి లింఫోమాస్, 33%) 10 మరియు బి-సెల్ నాన్-హాడ్కిన్ లింఫోమాస్ (పెద్ద బి-సెల్ లింఫోమా, 12%; మాంటిల్ సెల్ లింఫోమా, 4%) 11, 12 . TET2 లోని ఉత్పరివర్తనలు 70 ఏళ్లు పైబడిన (> 5%) ఆరోగ్యకరమైన వ్యక్తులలో కూడా ప్రబలంగా ఉన్నాయి మరియు ఇవి తరచుగా క్లోనల్ హేమాటోపోయిసిస్ 13 తో సంబంధం కలిగి ఉంటాయి. ఈ ఫలితాలు TET2 ఉత్పరివర్తనలు పూర్వీకుల సంఘటనలు, ఇవి అనాలోచిత క్లోనల్ పెరుగుదలను నడిపిస్తాయి మరియు హేమాటోలాజికల్ ప్రాణాంతక పరివర్తనను సులభతరం చేస్తాయి. నిజమే, ఎలుకలలో టెట్ 2 నష్టం హేమాటోపోయిటిక్ స్టెమ్ సెల్ (హెచ్ఎస్సి) స్వీయ-పునరుద్ధరణకు దారితీస్తుంది మరియు మైలోయిడ్ ప్రాణాంతకత 14, 15, 16, 17 యొక్క తదుపరి అభివృద్ధికి దారితీస్తుంది . పనితీరు కోల్పోవడం TET2 ఉత్పరివర్తనలు మరియు TET2 నష్టం 5mC మరియు 5hmC ప్రొఫైల్స్ 14, 18 కు దారితీస్తుంది, మరియు కణితి-అణచివేసే ఫంక్షన్ 19 ను అమలు చేయడానికి TET2 కు HSC / హేమాటోపోయిటిక్ ప్రొజెనిటర్ కణాలలో (HPC లు) దాని ఉత్ప్రేరక చర్య అవసరమని మేము ఇటీవల చూపించాము. ఏదేమైనా, TET2 నష్టం విభిన్న హేమాటోలాజికల్ ప్రాణాంతకతలకు దారితీసే విధానాలు ఎక్కువగా తెలియవు.

HSC లు / HPC లలో ఉత్పరివర్తనాల సంచితం హేమాటోపోయిటిక్ పనితీరుకు హానికరం మరియు హేమాటోలాజికల్ ప్రాణాంతకతను ప్రోత్సహిస్తుంది. ఇక్కడ మన Tet2 - / - మౌస్ నమూనాలు మరియు మిశ్రమ జీవ, బయోఇన్ఫర్మేటిక్స్ మరియు జన్యు విధానాలను ఉపయోగించి, TET2 HSC లు / HPC లను జన్యుసంబంధమైన ఉత్పరివర్తనానికి వ్యతిరేకంగా కాపాడుతుంది. Tet2 - / - కణితుల యొక్క ఎక్సోమ్ సీక్వెన్సింగ్ మరియు ప్రీమాలిగ్నెంట్ వైల్డ్-టైప్ (WT) మరియు Tet2 - / - HSC లు / HPC ల యొక్క లక్ష్య సింగిల్-సెల్ ఎక్సోమ్ సీక్వెన్సింగ్ TET2 నష్టం HSC లు / HPC లలో జన్యు హైపర్‌ముటబిలిటీకి దారితీస్తుందని చూపిస్తుంది. Tet2 నష్టం Tet2 నష్టంపై 5hmC ని పొందిన జన్యు సైట్ల వద్ద గణనీయంగా ఎక్కువ పరస్పర పౌన frequency పున్యానికి దారితీస్తుందని మేము చూస్తాము, ఇక్కడ TET2 సాధారణంగా బంధిస్తుంది. TET2 మరియు TET2- మధ్యవర్తిత్వం కలిగిన 5 mC ఆక్సీకరణ కణాలను జన్యు ఉత్పరివర్తనానికి వ్యతిరేకంగా కాపాడుతుందని మా ఫలితాలు సూచిస్తున్నాయి. ఈ అన్వేషణలు విభిన్న శ్రేణి హేమాటోలాజికల్ ప్రాణాంతకతలలో TET2 నష్ట-మధ్యవర్తిత్వ వ్యాధికారక ఉత్పత్తికి దోహదపడే ఒక నవల యంత్రాంగాన్ని సూచిస్తున్నాయి.

ఫలితాలు

Tet2 - / - ఎలుకలు మైలోయిడ్ మరియు లింఫోయిడ్ ప్రాణాంతకతలను అభివృద్ధి చేస్తాయి

వివోలో టెట్ 2 నష్టం వల్ల కలిగే హేమాటోలాజికల్ ప్రాణాంతకత యొక్క పూర్తి స్పెక్ట్రంను గుర్తించడానికి, మేము 198 టెట్ 2 - / - మరియు 67 డబ్ల్యూటి ఎలుకల సమిష్టిపై 2 సంవత్సరాల తదుపరి అధ్యయనాన్ని నిర్వహించాము. అన్ని Tet2 - / - ఎలుకలు 3 నుండి 22 నెలల వరకు మనుగడ వ్యవధితో ఆకస్మిక ప్రాణాంతక హేమాటోలాజికల్ ప్రాణాంతకతలను అభివృద్ధి చేశాయి, అయితే WT ఎలుకల హేమాటోపోయిటిక్ అవయవాలలో అసాధారణతలు కనుగొనబడలేదు (Fig. 1a, b). మునుపటి పరిశీలనలకు అనుగుణంగా 14, 15, 16, 92% ఎలుకలు మైలోయిడ్ ప్రాణాంతకతలను అభివృద్ధి చేశాయి, మోనోసైటోసిస్ / న్యూట్రోఫిలియా, హెపాటోస్ప్లెనోమెగలీ మరియు ఎముక మజ్జ (బిఎమ్) లో బాగా-విభిన్న మైలోయిడ్ కణాలు లేదా ఎరిథ్రాయిడ్ పూర్వగాములు, ప్లీహము మరియు కాలేయం (అనుబంధ Fig. 1). ఈ 198 Tet2 - / - ఎలుకల విశ్లేషణలు 3.5% Tet2 - / - ఎలుకలు T- సెల్ ప్రాణాంతకతలను అభివృద్ధి చేశాయి మరియు 4.5% Tet2 - / - ఎలుకలు B- సెల్ ప్రాణాంతకతలను అభివృద్ధి చేశాయి (Fig. 1b-h, అనుబంధ Fig. 2. మరియు అనుబంధ పట్టికలు 1 మరియు 2). ఈ ఎలుకలు వైవిధ్య లింఫోసైట్లు, లెంఫాడెనోపతి, హెపాటోస్ప్లెనోమెగలీ మరియు విస్తరించిన థైమస్‌లతో కూడిన గుర్తించబడిన లింఫోసైటోసిస్‌ను ప్రదర్శించాయి, చాలా సందర్భాలలో టి-సెల్ ప్రాణాంతకతతో (Fig. 1 సి, డి).

Image

( ) కాలక్రమేణా WT ( n = 67) మరియు Tet2 - / - ( n = 198) ఎలుకల మనుగడ. ( బి ) 198 టెట్ 2 - / - ఎలుకలలో అభివృద్ధి చెందిన హేమాటోలాజికల్ ప్రాణాంతక రకాలు. ( సి ) T- సెల్ (ఎగువ) లేదా B- సెల్ (దిగువ) ప్రాణాంతకత మరియు వయస్సు-సరిపోలిన WT ఎలుకలతో ప్రతినిధి Tet2 - / - ఎలుకల నుండి శోషరస కణుపులు, ప్లీహము, కాలేయం మరియు / లేదా థైమస్ యొక్క స్థూల స్వరూపాలు. ( డి ) మే-గ్రన్వాల్డ్-జిమ్సా-స్టెయిన్డ్ పిబి స్మెర్స్ ప్రతినిధి డబ్ల్యుటి మౌస్ మరియు టెట్ 2 - / - ఎలుకల నుండి టి- మరియు బి-సెల్ ప్రాణాంతకతలతో (స్కేల్ బార్, 20 μm) తయారు చేస్తారు. ( ) BM లోని టి-సెల్ వంశం (సిడి 4 / సిడి 8) యొక్క ఫ్లో సైటోమెట్రిక్ విశ్లేషణ, ప్రతినిధి టెట్ 2 - / - ఎలుకల టి-సెల్ ప్రాణాంతకత మరియు వయస్సు-సరిపోలిన డబ్ల్యూటి మౌస్ యొక్క ఎలుకలు. ( ఎఫ్ ) T- సెల్ ప్రాణాంతకత మరియు వయస్సు-సరిపోలిన WT మౌస్ (స్కేల్ బార్, × 25, 200 μm; × 50, 100) తో Tet2 - / - ఎలుక నుండి ఎముక, ప్లీహము మరియు కాలేయం యొక్క H & E- స్టెయిన్డ్ విభాగాల హిస్టోలాజికల్ విశ్లేషణ. μm; × 400, 12.5 μm). ( g ) BM లోని B- సెల్ వంశం (B220 / IgM) యొక్క ఫ్లో సైటోమెట్రిక్ విశ్లేషణ మరియు ప్రతినిధి Tet2 - / - ప్లీహము B- సెల్ ప్రాణాంతకత మరియు వయస్సు-సరిపోలిన WT మౌస్. ( h ) B- సెల్ ప్రాణాంతకత మరియు వయస్సు-సరిపోలిన WT మౌస్ (స్కేల్ బార్, × 25, 200 μm; × 50, 100) తో Tet2 - / - ఎలుక నుండి ఎముక, ప్లీహము మరియు కాలేయం యొక్క H & E- స్టెయిన్డ్ విభాగాల హిస్టోలాజికల్ విశ్లేషణ. μm; × 400, 12.5 μm).

పూర్తి పరిమాణ చిత్రం

ఏడు టెట్ 2 - / - నుండి ప్లీహము మరియు బిఎమ్ కణాల ఫ్లో సైటోమెట్రిక్ విశ్లేషణలు టి-సెల్ ప్రాణాంతకతతో ఎలుకలు అధిక ఫార్వర్డ్ స్కాటర్‌తో సిడి 3 + టి లింఫోసైట్ల యొక్క ఆధిపత్య నిష్పత్తిని వెల్లడించాయి; ఈ ఏడు జంతువులలో ఐదు సిడి 4 ను వారి టి లింఫోసైట్లలో సిడి 44 మరియు పిడి 1 లకు ఎక్కువగా సానుకూలంగా వ్యక్తం చేశాయి (Fig. 1e, సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 2 ఎ, బి మరియు సప్లిమెంటరీ టేబుల్ 1). BM, ప్లీహము, కాలేయం మరియు థైమస్ ఈ అవయవాల యొక్క సాధారణ నిర్మాణాన్ని ప్రభావితం చేసే లేదా వక్రీకరించే విలక్షణమైన లింఫోయిడ్ చొరబాట్లను కలిగి ఉన్నాయి (Fig. 1f మరియు అనుబంధ Fig. 2c). వైవిధ్య లింఫోసైట్లు మధ్యస్థ పరిమాణంలో ఉండేవి, తక్కువ మొత్తంలో సైటోప్లాజమ్ మరియు WT కి సంబంధించి క్రమరహిత కేంద్రకాలు. ప్లీహము ఎరుపు మరియు తెలుపు గుజ్జుతో కూడిన విస్తరించిన లింఫోయిడ్ చొరబాట్లను చూపించింది. కాలేయం సైనూసోయిడల్ మరియు పెరివాస్కులర్ చొరబాట్లను ప్రదర్శించింది. అదనంగా, మోనోమార్ఫిక్ టి-సెల్ చొరబాట్లతో పరీక్షించిన ప్రతి టెట్ 2 - / - ఎలుకల నుండి స్ప్లెనిక్ సిడి 3 + కణాలు క్లోనల్ టి-సెల్ రిసెప్టర్ పునర్వ్యవస్థీకరణ నమూనాలను చూపించాయి (అనుబంధ Fig. 2f).

B- సెల్ ప్రాణాంతకత కలిగిన తొమ్మిది Tet2 - / - ఎలుకలలో, ప్లీహము మరియు BM కణాలు ప్రధానంగా B220 + / lo IgM + / lo CD19 + CD43 + TdT - B లింఫోసైట్లు అధిక ఫార్వర్డ్ స్కాటర్‌తో ఉన్నాయి (Fig. 1g, అనుబంధ Fig. 2d మరియు అనుబంధ పట్టిక 2). ఈ నాలుగు ఎలుకల నుండి బి లింఫోసైట్లు CD5 (అనుబంధ పట్టిక 2) ను వ్యక్తం చేశాయి. ఈ టెట్ 2 - / - ఎలుకలలో బి కణాల నియోప్లాస్టిక్ మోనోమార్ఫిక్ విస్తరణలు గమనించబడ్డాయి. BM, ప్లీహము, కాలేయం, శోషరస కణుపు మరియు చిన్న ప్రేగులలో (Fig. 1h మరియు అనుబంధ Fig. 2e) వైవిధ్య లింఫోయిడ్ చొరబాట్లను గుర్తించారు. వైవిధ్య లింఫోసైట్లు ప్రధానంగా మధ్యస్థ పరిమాణంలో ఉండేవి, WT కి సంబంధించి తక్కువ మొత్తంలో సైటోప్లాజంతో మరియు క్రమరహిత అణు వెసిక్యులర్ మరియు ఘనీకృత న్యూక్లియర్ క్రోమాటిన్‌తో. ప్లీహము ప్రధానంగా తెల్ల గుజ్జుతో కూడిన నోడ్యులర్ లింఫోయిడ్ చొరబాటుతో సాధారణ నిర్మాణాన్ని ప్రదర్శిస్తుంది. కాలేయం పెరివాస్కులర్ మరియు సైనూసోయిడల్ చొరబాట్లను ప్రదర్శిస్తుంది. పేగు లింఫోయిడ్ నోడ్యూల్స్‌తో లింఫోపీథెలియల్ గాయాలను చూపించింది. అదనంగా, పరీక్షించిన ప్రతి Tet2 - / - నుండి స్ప్లెనిక్ B220 + కణాలు మోనోమోర్ఫిక్ B- సెల్ చొరబాట్లతో ఎలుకలు IgH D-J పునర్వ్యవస్థీకరణకు క్లోనల్‌గా ఉన్నాయి (అనుబంధ Fig. 2g).

Tet2 - / - ఎలుకలలోని లింఫోయిడ్ ప్రాణాంతకత మార్పిడి చేయగలదు

Tet2 - / - ఎలుకలలో అసాధారణంగా చొరబడిన T మరియు B లింఫోసైట్ల యొక్క ప్రాణాంతక స్వభావాన్ని అంచనా వేయడానికి, ఒక WT మౌస్ నుండి ప్లీహ కణాలు మరియు రెండు Tet2 - / - ప్రాణాంతకతతో ఎలుకలు, ఒకటి T- సెల్ క్లోన్ (G3-6) మరియు ఒకటి B- సెల్ క్లోన్ (G3-185) తో, ఉపశమన వికిరణం చేసిన WT గ్రహీతలు (Fig. 2a) లోకి నాటుతారు. డబ్ల్యుటి ప్లీహ కణాలను స్వీకరించే గ్రహీతలు మార్పిడి చేసిన 6 నెలల్లోనే వ్యాధికి సంబంధించిన ఆధారాలను అభివృద్ధి చేయలేదు (Fig. 2b). దీనికి విరుద్ధంగా, T- లేదా B- సెల్ ప్రాణాంతకంతో Tet2 - / - ఎలుకల నుండి ప్లీహ కణాలను స్వీకరించే అన్ని ఎలుకలు ప్రాధమిక ఎలుకలో గమనించిన లక్షణాలతో వ్యాధులను అభివృద్ధి చేశాయి, ఉదాహరణకు, ఎలివేటెడ్ WBC గణనలు, లింఫోసైటోసిస్, స్ప్లెనోమెగలీ, విస్తరించిన శోషరస కణుపులు మరియు అకాల మరణం (Fig. 2b). గ్రహీతల పరిధీయ రక్తం (పిబి) కణాల ఫ్లో సైటోమెట్రిక్ విశ్లేషణ యూనిఫాం, దాత సెల్-ఉత్పన్నం, టి- (సిడి 45.2 + సిడి 4 + సిడి 8 + ) లేదా బి- (సిడి 45.2 + బి 220 + ఐజిఎం తక్కువ ) సెల్ జనాభా యొక్క చొరబాట్లను వెల్లడించింది., సంబంధిత ప్రాధమిక Tet2 - / - మౌస్ (Fig. 2c, d) లో మనం చూసిన మాదిరిగానే. Tet2 - / - B- మరియు T- సెల్ ప్రాణాంతకత ఉపశీర్షికగా వికిరణం చేసిన WT ఎలుకలలోకి మార్పిడి చేయబడినందున , ఈ Tet2 - / - ఎలుకలలో T లేదా B లింఫోసైట్‌లలోకి చొరబడటం నిజంగా ప్రాణాంతక / నియోప్లాస్టిక్. సమిష్టిగా, ఈ డేటా మైలోయిడ్ ప్రాణాంతకతతో పాటు, టెట్ 2 - / - ఎలుకలు ప్రాణాంతకమైన టి- మరియు బి-సెల్ ప్రాణాంతకతలను అభివృద్ధి చేస్తాయి, ఇవి మానవ పరిధీయ టి-సెల్ లింఫోమాను పోలి ఉంటాయి మరియు వరుసగా పేర్కొనబడని మరియు తీవ్రమైన బి-లింఫోసైటిక్ లుకేమియాను పోలి ఉంటాయి. ఈ పరిశోధనలు TET2 లోని ఫంక్షన్-ఆఫ్-ఫంక్షన్ ఉత్పరివర్తనలు మైలోయిడ్ మరియు B- మరియు T- సెల్ ప్రాణాంతకత 6, 7, 8, 9, 10, 11, 16 యొక్క ఉపరకాలు రెండింటిలోనూ తరచుగా జరుగుతాయని క్లినికల్ పరిశీలనలకు అనుగుణంగా ఉన్నాయి.

Image

( ) కణితి బదిలీ స్కీమా. T- లేదా B- సెల్ ప్రాణాంతకంతో లేదా వయస్సు-సరిపోలిన WT మౌస్ నుండి ప్రతినిధి Tet2 - / - ఎలుకల నుండి ప్లీహ కణాలు (1 × 10 6 ) ఉపశీర్షిక వికిరణం (600 cGy) CD45.1 + /CD45.2 + ఎఫ్ 1 గ్రహీతలు. ( బి ) కప్లాన్-మీర్ మనుగడ వక్రత (ఐదు ఎలుకలు / దాత) ప్లీహ కణాలతో టెట్ 2 - / - ఎలుకల నుండి టి-సెల్ (ఎరుపు) లేదా బి-సెల్ (నీలం) ప్రాణాంతకతతో లేదా ఒక డబ్ల్యుటి (నలుపు) నుండి నాటుతారు. మౌస్. ( సి ) WT మౌస్ నుండి ప్లీహ కణాలను స్వీకరించే ఎలుక నుండి పిబి టి-సెల్ వంశం (సిడి 4 / సిడి 8) దాత కణాల (సిడి 45.2 + ) ఫ్లో సైటోమెట్రిక్ విశ్లేషణలు లేదా టి-సెల్ ప్రాణాంతకంతో టెట్ 2 - / - మౌస్. ( డి ) WT మౌస్ నుండి ప్లీహ కణాలను స్వీకరించే ఎలుక నుండి పరిధీయ రక్తం B- సెల్ వంశం (B220 / IgM) దాత కణాలు (CD45.2 + ) యొక్క ఫ్లో సైటోమెట్రిక్ విశ్లేషణలు లేదా B- సెల్ ప్రాణాంతకంతో Tet2 - / - ఎలుక.

పూర్తి పరిమాణ చిత్రం

Tet2 నష్టం HSC లు / HPC లలో హైపర్‌ముటాజెనిసిటీకి దారితీస్తుంది

Tet2 - / - ఎలుకలలోని హేమాటోలాజికల్ ప్రాణాంతకత ద్వారా గతిశాస్త్రం మరియు బహుళ వంశాల ప్రమేయం ఈ ఎలుకలలో అదనపు జన్యు గాయాలను పొందవచ్చని సూచిస్తున్నాయి, దీని ఫలితంగా వ్యాధికారక మరియు / లేదా వివిధ హేమాటోలాజికల్ ప్రాణాంతకత యొక్క పురోగతి ఏర్పడుతుంది. ఈ అవకాశాన్ని అన్వేషించడానికి, టెట్ 2 - / - ఎలుకల నుండి కణితి మరియు నాన్-ట్యూమర్ కణాలను ఉపయోగించి తులనాత్మక జెనోమిక్ హైబ్రిడైజేషన్ శ్రేణులు మరియు మొత్తం-ఎక్సోమ్ సీక్వెన్సింగ్ (WES) ను మైలోయిడ్, టి- లేదా బి-సెల్ ప్రాణాంతకతతో ప్రదర్శించారు. తులనాత్మక జన్యు సంకరీకరణ శ్రేణులు మైలోయిడ్, టి- మరియు బి-సెల్ ప్రాణాంతకతలలో (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 3 ఎ మరియు సప్లిమెంటరీ డేటా 1) వివిధ రకాల నిర్మాణ క్రోమోజోమ్ అసాధారణతలను గుర్తించాయి. ఈ క్రోమోజోమ్ తొలగింపులు / లాభాల యొక్క మరింత పరిశీలనలో గతంలో ట్యూమరిజెనిసిస్‌తో ముడిపడి ఉన్న జన్యువులతో సంబంధం ఉన్న నిర్దిష్ట ప్రాంతాలు ఏవీ లేవు. కణితి రకానికి సగటున 10, 156 నాన్‌సైనమస్ రీప్లేస్‌మెంట్ సైట్‌లు మరియు 15, 809 సైలెంట్ సైట్‌లు (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్ 3 బి మరియు సప్లిమెంటరీ డేటా 2) WES వెల్లడించింది. మైలోయిడ్, టి- లేదా బి-సెల్ మూలం యొక్క టెట్ 2 - / - కణితుల్లో, వివిధ కణితుల నుండి ఉద్భవించే పునరావృత సింగిల్-న్యూక్లియోటైడ్ వేరియంట్లు (ఎస్ఎన్వి) తో 190 జన్యువులను కనుగొన్నాము. జన్యు జాబితాలో APC , Nf1 , Flt3 , Cbl , Notch1 మరియు Mll2 (Fig. 3a మరియు సప్లిమెంటరీ డేటా 3) ఉన్నాయి, జన్యువులు మానవ హేమాటోలాజికల్ ప్రాణాంతకతలలో 20, 21, 22, 23, 24 లో పునరావృతమవుతాయి. NOTCH1 యొక్క హెటెరోడైమైరైజేషన్ మరియు ప్రోలిన్-గ్లూటామిక్ ఆమ్లం-సెరైన్-థ్రెయోనిన్-రిచ్ డొమైన్లు మానవ T-ALL 24 లోని పరస్పర హాట్‌స్పాట్‌లు. Tet2 - / - లో ఎక్సోమ్ సీక్వెన్సింగ్ మరియు సాంగర్ సీక్వెన్సింగ్ ద్వారా గుర్తించబడిన నాచ్ 1 ఉత్పరివర్తనలు ఈ హాట్‌స్పాట్లలో (Fig. 3b) కనుగొనబడ్డాయి, ఇవి అదనపు నాచ్ 1 ఉత్పరివర్తనలు Tet2 - / - ఎలుకలలో పొందవచ్చని మరియు Tet2 - / - ఎలుకలలో ప్రారంభించబడతాయని సూచిస్తున్నాయి. T- సెల్ ప్రాణాంతకత.

Image

( ) WES గుర్తించినట్లు Tet2 - / - మైలోయిడ్, B- లేదా T- సెల్ వంశం యొక్క కణితుల్లో ఎంచుకున్న పునరావృత జన్యు ఉత్పరివర్తనలు. ( బి ) ఆరు టెట్ 2 - / - టి-సెల్ కణితుల్లో ఎక్సోమ్ -సీక్వెన్సింగ్ మరియు / లేదా సాంగర్ సీక్వెన్సింగ్ ద్వారా గుర్తించబడిన నాచ్ 1 జన్యు ఉత్పరివర్తనలు సంగ్రహించబడ్డాయి (తక్కువ). నాచ్ 1 లోని హెటెరోజైగస్ మ్యుటేషన్లతో నాలుగు టెట్ 2 - / - టి-సెల్ కణితుల సాంగర్ సీక్వెన్స్ జాడలు చూపించబడ్డాయి (మధ్య). పరస్పర స్థానాలు మౌస్ NOTCH1 ప్రోటీన్ స్కీమాటిక్ ప్రాతినిధ్యం (ఎగువ) లో ఎరుపు ఆస్టరిస్క్‌లుగా చూపబడతాయి. ( సి ) సింగిల్-సెల్-టార్గెటెడ్ ఎక్సోమ్ సీక్వెన్సింగ్ (ఫిషర్ యొక్క ఖచ్చితమైన పరీక్ష, పి <0.001) ద్వారా డబ్ల్యుటి ఎల్కె కణాలతో పోలిస్తే ప్రీమాలిగ్నెంట్ టెట్ 2 - / - ఎల్కె కణాలలో గణనీయంగా ఎక్కువ ఉత్పరివర్తనలు కనిపిస్తాయి.

పూర్తి పరిమాణ చిత్రం

Tet2 - / - ఎలుకలలోని కణితులతో సంబంధం ఉన్న ఉత్పరివర్తనలు సోమాటిక్ అని ధృవీకరించడానికి, మేము ప్రిమాలిగ్నెంట్ (6 వారాల వయస్సు) WT, Tet2 +/− మరియు నుండి వేరుచేయబడిన లిన్ - సి-కిట్ + (LK) కణాలను ఉపయోగించి అదనపు WES ను ప్రదర్శించాము. Tet2 - / - ఎలుకలు. WES, Tet2 +/− మరియు Tet2 - / - ఎలుకల నుండి ప్రీమాలిగ్నెంట్ LK కణాలలో కొన్ని ఉత్పరివర్తనాలను WES విశ్లేషణలు గుర్తించాయి, ఎందుకంటే జన్యు మార్పులు ఆధిపత్య LK సెల్ క్లోన్ (సప్లిమెంటరీ డేటా 4) లో మాత్రమే గుర్తించబడతాయి, కాబట్టి Tet2 - / - లో గుర్తించిన వైవిధ్యాలు కణితులు జెర్మ్‌లైన్ కాకుండా కాలక్రమేణా టెట్ 2 - / - కణాలలో పేరుకుపోయే సోమాటిక్ ఉత్పరివర్తనలు. ఈ పరిమితిని అధిగమించడానికి, WT మరియు ప్రిమాలిగ్నెంట్ టెట్ 2 - / - ఎల్కె కణాలను ఉపయోగించి సింగిల్-సెల్ స్థాయిలో ఎంచుకున్న లోకి ( టెట్ 2 - / - ట్యూమర్ ఎస్ఎన్విల నుండి) పై లక్ష్యంగా సీక్వెన్సింగ్ చేసాము . ఆసక్తికరంగా, WT LK కణాలతో (Fig. 3c మరియు సప్లిమెంటరీ టేబుల్ 3) పోలిస్తే Tet2 - / - LK కణాలలో ఎంచుకున్న 13 లోకీలలో ఏడు ఉత్పరివర్తనాల యొక్క అధిక పౌన frequency పున్యాన్ని మేము గమనించాము , ఇది Tet2 - / - LK కణాలు హైపర్‌ముటాజెనిక్ అని సూచిస్తున్నాయి .

సంపాదించిన -5 హెచ్‌ఎంసి శిఖరాలతో సైట్‌లలో అధిక పరస్పర భారం

5 ఎంసి ఆక్సీకరణ ప్రక్రియలో టిఇటి ప్రోటీన్ల పాత్రను బట్టి, జన్యు-వ్యాప్తంగా 5 హెచ్‌ఎంసి మరియు 5 ఎంసి సవరణలపై టెట్ 2 నష్టం యొక్క ప్రభావాన్ని మేము పరిశీలించాము. ప్రీమాలిగ్నెంట్ WT మరియు Tet2 - / - LK కణాలలో (సప్లిమెంటరీ డేటా 5) జన్యు-వ్యాప్తంగా 5 హెచ్‌ఎంసి పంపిణీలను మ్యాప్ చేయడానికి మేము సెలెక్టివ్ కెమికల్ లేబులింగ్ మరియు అఫినిటీ ఎన్‌రిచ్మెంట్ విధానం 25 ను వర్తింపజేసాము . మౌస్ పిండ మూల కణాలు 26 లో మునుపటి పరిశీలనలకు అనుగుణంగా, 5 హెచ్‌ఎంసి యొక్క గణనీయమైన తగ్గింపులు ఎల్‌కె కణాలలో మధ్యస్థంగా లేదా తక్కువగా వ్యక్తీకరించబడిన జన్యువుల శరీరాలకు పరిమితం చేయబడ్డాయి. Tet2 - / - LK కణాలలో (Fig. 4a మరియు అనుబంధ Fig. 4a) అధికంగా వ్యక్తీకరించబడిన జన్యువులలో 5hmC ప్రభావితం కాలేదు. LK కణాలలో చాలా TET2- ఆధారిత 5hmC మార్పులు జన్యువులలోనే ఉన్నాయి (Fig. 4b). మేము అప్పుడు Tet2 - / - కణితులు మరియు మూడు వేర్వేరు జన్యు స్థానాలలోని SNV లు / ఇండెల్‌లతో ఉన్న సైట్‌ల మధ్య అతివ్యాప్తిని అన్వేషించాము: (1) 5hmC / 5mC శిఖరాలలో మార్పు లేని సైట్లు, బహుశా TET1 / 3 చేత ఉత్ప్రేరకమైన 5mC ఆక్సీకరణంతో సైట్‌లను సూచిస్తాయి, కానీ TET2 కాదు; (2) TET2 ద్వారా 5hmC గా మార్చబడిన 5mC సైట్‌లను సూచించే 5hmC పీక్ లాస్ లేదా 5mC పీక్ లాభం కలిగిన సైట్లు; మరియు (3) 5hmC గరిష్ట లాభంతో సైట్లు, TET2 (Fig. 4c) ద్వారా 5fC / 5caC కు మరింత ఆక్సీకరణం చెందే 5hmC సైట్‌లను సూచిస్తాయి. H 2 పరీక్షను ఉపయోగించి, TET2 యొక్క ప్రధాన పాత్ర 5hmC యొక్క మరింత ఆక్సీకరణం కావడంతో, Tet2 - / - లో SNV లు / ఇండెల్స్ యొక్క గణనీయమైన ఎక్కువ పౌన frequency పున్యాన్ని 5hmC / 5mC శిఖరాలలో మార్పు లేకుండా లోకితో పోలిస్తే 5hmC గరిష్ట లాభాలతో లోకి వద్ద కణితులు చూశాము. మరియు 5hmC గరిష్ట నష్టం లేదా 5mC గరిష్ట లాభంతో లోకి (Fig. 4d, e మరియు అనుబంధ Fig. 4b, c). సి-టు-టి (లేదా జి-టు-ఎ) ఉత్పరివర్తనలు (అనుబంధ Fig. 4b) తో కూడా ఇలాంటి పెరుగుదల గమనించబడింది. 5hmC గరిష్ట లాభంతో లోకి వద్ద ఈ పరస్పర సంభవం సాంప్రదాయ బిసాల్ఫైట్ సీక్వెన్సింగ్ మరియు TT- సహాయక బిసాల్ఫైట్ సీక్వెన్సింగ్ ద్వారా సిపిజి సైట్లలో వేర్వేరు దూరాలతో (100 బిపి) WT మరియు ప్రిమాలిగ్నెంట్ టెట్ 2 - / - ఎల్కె కణాలను ఉపయోగించి సెలెక్టివ్ మ్యుటేషన్లకు (WES చేత కనుగొనబడింది), ఇది సైట్‌లతో పోలిస్తే 100 బిపి దూరంలో (10 లో 1, పి <0.05, ఫిషర్ యొక్క ఖచ్చితమైన ప్రకారం) మ్యుటేషన్ సైట్ల నుండి (10 లో 7) 30 బిపి లోపల సైట్‌లలో 5 హెచ్‌ఎంసి లాభంతో సిపిజి సైట్‌లలో గణనీయంగా ఎక్కువ శాతం చూపించింది. పరీక్ష) మ్యుటేషన్ సైట్ల నుండి (అనుబంధ Fig. 4d, e). కలిసి, Tet2 నష్టంపై 5hmC గరిష్ట లాభంతో ఉన్న లోకీ అధిక పరస్పర పౌన .పున్యంతో సంబంధం కలిగి ఉంటుంది.

Image

( ) WT మరియు Tet2 - / - LK కణాలలోని అన్ని జన్యువుల వద్ద సగటు 5hmC సుసంపన్నత పంపిణీ. ( బి ) LK కణాలలో జన్యు లక్షణాలతో 5hmC- సుసంపన్న ప్రాంతాల సంఘం. నిర్వచించిన జన్యు లక్షణాన్ని అతివ్యాప్తి చేసే 5 హెచ్‌ఎంసి-సుసంపన్న ప్రాంతాల శాతాన్ని ఆ ప్రాంతం యొక్క జన్యు కవరేజ్ ఆధారంగా అనుకోకుండా నిర్దిష్ట ప్రాంతంలో పడిపోతుందని అంచనా వేసిన శాతంతో పోల్చారు. విలువలు .హించినదానికంటే రెట్లు మార్పుగా వ్యక్తీకరించబడతాయి. ( సి ) 5 హెచ్‌ఎంసి లోకి యొక్క మూడు వర్గాలు: (1) 5 హెచ్‌ఎంసి / 5 ఎంసి శిఖరాలలో మార్పు లేని సైట్లు, (2) 5 హెచ్‌ఎంసి పీక్ లాస్ లేదా 5 ఎమ్‌సి పీక్ లాభం ఉన్న సైట్లు, ఇందులో టిఇటి 2 మొదటి ఆక్సీకరణ దశకు బాధ్యత వహిస్తుంది మరియు (3) 5 హెచ్‌ఎంసి ఉన్న సైట్లు రెండవ మరియు బహుశా మూడవ ఆక్సీకరణ దశలకు TET2 కారణమైన గరిష్ట లాభాలు. ( d, e ) Tet2 - / - లోని మొత్తం SNV లు / ఇండెల్స్ యొక్క గణనీయమైన ఎక్కువ పౌన encies పున్యాలు 5hmC గరిష్ట లాభాలతో లోకీలో సంభవిస్తాయి, కాని 5hmC / 5mC శిఖరాలలో ఎటువంటి మార్పు లేకుండా మరియు 5hmC గరిష్ట నష్టాలతో లేదా 5mC గరిష్ట లాభాలతో లోకీలో కాదు (5mC గరిష్ట లాభాలు) d, పి = 0.0003, 2 పరీక్ష). Tet2 నష్టం, TET2- బైండింగ్ ప్రొఫైల్ మరియు Rccd1 ఉత్పరివర్తనలు ( e ) పై పొందిన -5hmC సైట్‌లలో అతివ్యాప్తి లక్షణాలను చూపించే ఉదాహరణ జన్యు వీక్షణ. ( ఎఫ్ ) TET2 నష్టం ( P = 3.4e - 76, χ 2 పరీక్ష) పై 5hmC గరిష్ట లాభాలతో TET2 జన్యుసంబంధమైన ప్రదేశంలో మరింత సమృద్ధిగా ఉంటుంది. లోపం పట్టీలు, sd ( g ) వెన్ రేఖాచిత్రం TET2- బైండింగ్ సైట్‌ల మధ్య అతివ్యాప్తి చెందుతుంది మరియు WES చేత కనుగొనబడినట్లుగా, DhMR లలో Tet2 నష్టంతో సంబంధం ఉన్న SNV లు / ఇండెల్స్ ఉత్పరివర్తనలు.

పూర్తి పరిమాణ చిత్రం

MEL లో TET2 యొక్క జన్యు-వ్యాప్త బైండింగ్ సైట్‌లను మ్యాప్ చేయడానికి క్రోమాటిన్ ఇమ్యునోప్రెసిపిటేషన్ సీక్వెన్సింగ్‌ను ఉపయోగించాము (ఒక మౌస్ ఎరిథ్రోలెయుకేమియా సెల్ లైన్) కణాలు FLAG- ట్యాగ్ చేయబడిన TET2 (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 5a, బి మరియు సప్లిమెంటరీ డేటా 6). ఎక్సోన్లు, 5′-అనువదించని ప్రాంతం మరియు సిపిజి ద్వీపాలు (అనుబంధ Fig. 5 సి) ఉన్న ప్రాంతాలలో TET2- బైండింగ్ సైట్లు సమృద్ధిగా ఉన్నాయని జన్యు విశ్లేషణ వెల్లడించింది. మేము TET2 - / - LK కణాలలో భేదాత్మకంగా మిథైలేటెడ్ / హైడ్రాక్సీమీథైలేటెడ్ ప్రాంతాలతో TET2- బైండింగ్ సైట్‌లను విశ్లేషించాము మరియు మైలోయిడ్ మరియు B- సెల్ డిఫరెన్సియేషన్ (అనుబంధ Fig. 5d, e) లో పాల్గొన్న జన్యువులలో గణనీయమైన అతివ్యాప్తిని గమనించాము . ముఖ్యంగా, TET2 నష్టంపై 5hmC గరిష్ట లాభంతో TET2 లోకి వద్ద మరింత సమృద్ధిగా ఉంటుంది (Fig. 4f). ఇంకా, లోకీలో మేము కనుగొన్న ఎక్కువ ఉత్పరివర్తనలు TET2- బైండింగ్ సైట్‌లతో డైనమిక్ DNA డీమెథైలేషన్ అతివ్యాప్తి కోసం TET2 అవసరం (Fig. 4g; 212 మ్యుటేషన్ సైట్‌లలో 145). సమిష్టిగా, TET2 నష్టంపై 5hmC లాభంతో గుర్తించబడిన TET2 లోకితో బంధిస్తుందని మరియు ఈ సైట్లలో, TET2 జన్యు స్థిరత్వాన్ని కాపాడుతుందని ఈ ఫలితాలు సూచిస్తున్నాయి.

TET2 నష్టం పెరిగిన పరస్పర పౌన .పున్యంతో సంబంధం కలిగి ఉంటుంది

నియంత్రణలో ఉన్న హైపోక్సంథైన్-గ్వానైన్ ఫాస్ఫోరిబోసిల్ట్రాన్స్ఫేరేస్ 1 ( HPRT1 ) జన్యువు మరియు TET2 kd హెలా కణాలలో TET2 నష్టం ఆకస్మిక ఫార్వర్డ్ మ్యూచువల్ ఫ్రీక్వెన్సీని ప్రభావితం చేస్తుందా అని మేము తరువాత పరిశీలించాము. నియంత్రణ హెలా కణాలతో పోలిస్తే TET2 kd హెలా కణాలలో HPRT1 పరస్పర పౌన frequency పున్యం 24 రెట్లు పెరిగింది (Fig. 5a మరియు అనుబంధ Fig. 6a, b). నియంత్రణ మరియు Tet2 kd NIH3T3 కణాలు (అనుబంధ Fig. 6c, d) ఉపయోగించి ఇలాంటి ఫలితాలు పొందబడ్డాయి . TET2 యొక్క క్షీరద కోడాన్-ఆప్టిమైజ్ చేసిన సిడిఎన్ఎ క్రమాన్ని TET2 kd హెలా కణాలలో (సప్లిమెంటరీ Fig. 6e) కలిగి ఉన్న లెంటివైరల్ నిర్మాణాన్ని ఉపయోగించి మేము TET2 ని స్థిరంగా వ్యక్తీకరించినప్పుడు, HPRT1 పరస్పర పౌన encies పున్యాలు పూర్తిగా రక్షించబడ్డాయి (Fig. 5a). ఈ ఫలితాలు TET2 నష్టానికి మ్యుటేషన్ రేట్ల పెరుగుదలకు కారణమవుతాయని సూచిస్తున్నాయి. మేము HPRT1 జన్యువులో 6-థియోగువానిన్ (6-టిజి) లో గుర్తించబడిన ఉత్పరివర్తనాల వర్ణపటాన్ని విశ్లేషించాము- TET2 kd హెలా కణాల నిరోధక క్లోన్. ఆసక్తికరంగా, SNV లు మరియు సింగిల్-న్యూక్లియోటైడ్ చొప్పించడం / తొలగింపులు (ఇండెల్స్) HPRT1 జన్యువులోని ఉత్పరివర్తనాలను ఆధిపత్యం చేశాయి. TET2 kd క్లోన్లలో సుమారు 61% మరియు 36% ఉత్పరివర్తనలు వరుసగా పరివర్తనాలు మరియు పరివర్తనాలు, మరియు ∼ 3% ఇండెల్స్ (అనుబంధ Fig. 6f). మేము Tet2 - / - కణితుల యొక్క పరస్పర స్పెక్ట్రంను మరింత విశ్లేషించాము. మేము 5hmC గరిష్ట లాభాలతో లోకి వద్ద ఉన్న ఉత్పరివర్తనాలపై దృష్టి పెట్టాము. బేస్ పరివర్తన ఉత్పరివర్తనలు Tet2 - / - కణితుల్లోని పరస్పర స్పెక్ట్రంలో స్పష్టంగా ఆధిపత్యం చెలాయిస్తున్నాయి, G: C నుండి A: T పరివర్తనాలు మొత్తం ఉత్పరివర్తనాలలో 35% ఉన్నాయి. మిగిలిన ఉత్పరివర్తనలు ప్రధానంగా A: T నుండి G: C పరివర్తనాలు (23%), వివిధ పరివర్తనాలు (38%), G: C నుండి T తో: A చాలా తరచుగా ఉంటాయి మరియు + 1 / −1 ఇండెల్స్ (4%), −1 తొలగింపులు +1 (Fig. 5b) కన్నా సాధారణం. అన్ని ఉత్పరివర్తనాలలో, 73% సిపిజి సైట్లలో సంభవించాయి లేదా సిపిజి సైట్ల చుట్టూ సమూహంగా ఉన్నాయి (± 30 బిపి); జన్యువు అంతటా సిపిజి సైట్ల మధ్య సగటు దూరం 100 బిపి 27, 28 కాబట్టి, జన్యు శరీరాలలో <60% expected హించబడింది . CpG సైట్‌లతో మ్యుటేషన్ సైట్‌ల దగ్గరి అనుబంధం Tet2 - / - కణితుల్లోని CpG సైట్‌ల వద్ద లేదా చుట్టుపక్కల పరస్పర సంభవం యొక్క ప్రాధాన్యతను సూచిస్తుంది. TET2 kd మరియు Tet2 - / - కణాల యొక్క హైపర్‌ముటాజెనిసిటీ మరియు మ్యూచువల్ స్పెక్ట్రా మరియు 5mC ఆక్సీకరణ మరియు డీమెథైలేషన్‌లో TET2 / TDG యొక్క పనితీరు TET2 జన్యుసంబంధమైన ఉత్పరివర్తనతను కాపాడటంలో పాల్గొంటుందని సూచిస్తున్నాయి.

Image

( ) గిలకొట్టిన నియంత్రణ-, shTET2- మరియు shTET2 + TET2opt హెలా కణాలలో HPRT ఉత్పరివర్తనలు. ( బి ) టెట్ 2 - / - కణితి పరివర్తనాలు, పరివర్తనాలు మరియు ఇండెల్స్ యొక్క నిష్పత్తులు. ( సి ) WES MDS మరియు MDS / MPN కేసుల ( n = 41) మరియు లేకుండా ( n = 154) TET2 ఉత్పరివర్తనలు ( P = 0.001, విల్కాక్సన్ యొక్క ర్యాంక్-సమ్ టెస్ట్) తో నాన్‌సైనమస్ సోమాటిక్ మ్యుటేషన్ల సంఖ్యల పోలిక. ( డి ) TET2 ఉత్పరివర్తనాలతో మరియు లేకుండా AML కేసులలో నాన్‌సైనమస్ సోమాటిక్ మ్యుటేషన్ల సంఖ్యల పోలిక ( P = 0.04, విల్కాక్సన్ యొక్క ర్యాంక్-సమ్ టెస్ట్) TCGA ద్వారా ప్రాధమిక AML లకు మాత్రమే అందుబాటులో ఉంది. బాక్స్ ప్లాట్లు: ఎగువ మీసము, గరిష్ట విలువ 75% + 1.5 × IQR కన్నా తక్కువ; ఎగువ బాక్స్ ముగింపు, 75%; బార్, 50%; దిగువ బాక్స్ ముగింపు, 25%; తక్కువ మీసము, కనీసం విలువ 25% than1 కన్నా ఎక్కువ. × IQR. IQR, ఇంటర్‌క్వార్టైల్ పరిధి.

పూర్తి పరిమాణ చిత్రం

జత చేసిన నమూనాల ఎక్సోమ్ సీక్వెన్సింగ్ ఉపయోగించి సోమాటిక్ మ్యుటేషన్ల ఉనికి కోసం MDS మరియు MDS / MPN రోగుల (సప్లిమెంటరీ టేబుల్ 4) మరియు ఈ పరిస్థితులలో సాధారణంగా పరివర్తనం చెందిన 60 జన్యువుల ( TET2 తో సహా) లక్ష్యంగా ఉన్న లోతైన క్రమాన్ని మేము మరింత విశ్లేషించాము (అనుబంధ డేటా 7 ). WT TET2 (Fig. 5c) తో పోలిస్తే TET2 మ్యుటేషన్ ఉన్న రోగులు గణనీయమైన సంఖ్యలో పరస్పర సంఘటనలను కలిగి ఉన్నారని ఎక్సోమ్ విశ్లేషణ వెల్లడించింది. క్యాన్సర్ జీనోమ్ అట్లాస్ (టిసిజిఎ) లుకేమియా కోహోర్ట్ విశ్లేషించినప్పుడు (Fig. 5d) AML రోగి డేటాలో ఇలాంటి ఫలితాలు వచ్చాయి. TET2 ఉత్పరివర్తనాలతో ఉన్న MDS మరియు MDS / MPN రోగులలో గుర్తించబడిన 556 ఉత్పరివర్తనాలలో, 52% మరియు 12% వరుసగా పరివర్తనాలు మరియు ఇండెల్స్ (సప్లిమెంటరీ Fig. 6g), WT TET2 (సప్లిమెంటరీ Fig. 6h) రోగుల కంటే కొంచెం ఎక్కువ. సమిష్టి సమన్వయం యొక్క నిర్ధారణ డీప్ సీక్వెన్సింగ్ సోమాటిక్ TET2 ఉత్పరివర్తనలు ఇతర సబ్‌క్లోనల్ సంఘటనలతో సంబంధం కలిగి ఉన్నాయని చూపించాయి, ప్రధానంగా APC , NF1 , ASXL1 , CBL మరియు ZRSR2 . స్థిరంగా, ఈ జన్యువులలో చాలావరకు (ఉదాహరణకు, ఎపిసి , ఎన్ఎఫ్ 1 మరియు సిబిఎల్ ) టెట్ 2 - / - ఎలుకలలోని సబ్‌క్లోనల్ ఉత్పరివర్తనాల ద్వారా కూడా ప్రభావితమవుతాయి (Fig. 3a). TET2 ఉత్పరివర్తనాలతో బాధపడుతున్న రోగులలో సబ్‌క్లోనల్ సంఘటనల సంఖ్య పెరుగుదల Tet2 నష్టానికి అనుగుణంగా ఉంటుంది, ఇది HSC లు / HPC లలో జన్యు-వ్యాప్తంగా హైపర్‌ముటబిలిటీకి దారితీస్తుంది.

చర్చా

ఈ అధ్యయనంలో, మైలోయిడ్ ప్రాణాంతకతతో పాటు, Tet2 - / - ఎలుకలలో కొంత భాగం T- మరియు B- సెల్ ప్రాణాంతకతలను అభివృద్ధి చేస్తుంది. ఈ పరిశోధనలు TET2 లోని ఫంక్షన్-ఆఫ్-ఫంక్షన్ ఉత్పరివర్తనలు మానవ మైలోయిడ్ ప్రాణాంతకతలలో మాత్రమే కాకుండా, B- మరియు T- సెల్ ప్రాణాంతకత 6, 7, 8, 9, 10, 11, 16 యొక్క ఉప రకాల్లో కూడా ఉత్పన్నమవుతాయని క్లినికల్ పరిశీలనలకు అనుగుణంగా ఉన్నాయి. అందువల్ల, మా Tet2 - / - ఎలుకలు యంత్రాంగాల పరిశోధనలకు ఒక నమూనాగా ఉపయోగపడతాయి, దీని ద్వారా Tet2 నష్టం విభిన్న హేమాటోలాజికల్ ప్రాణాంతకతలకు దారితీస్తుంది. ల్యూకామోజెనిసిస్ అనేది జన్యు ఉత్పరివర్తనాలను పొందే మల్టీస్టెప్ ప్రక్రియ. లాస్-ఆఫ్-ఫంక్షన్ TET2 ఉత్పరివర్తనలు హేమాటోలాజికల్ ప్రాణాంతకత యొక్క వ్యాధికారకంలో సంఘటనలను ప్రారంభిస్తున్నాయి. ద్వితీయ ఆంకోజెనిక్ జన్యు ఉత్పరివర్తనలు సంభవించడం, బహుశా ప్రారంభ హేమాటోపోయిటిక్ ప్రొజెనిటర్‌లో, వ్యాధి సమలక్షణాన్ని సవరించడానికి మరియు / లేదా టెట్ 2 - / - ఎలుకలలో ఒక నిర్దిష్ట హేమాటోలాజికల్ ప్రాణాంతకత యొక్క పరివర్తన / పురోగతిని ప్రోత్సహించే సామర్థ్యాన్ని కలిగి ఉంటుంది. TET2 - / - కణితుల్లో WES అనేక SNV లు / ఇండెల్‌లను గుర్తించింది, TET2 నష్టం జన్యు ఉత్పరివర్తన స్థితి అని సూచిస్తుంది. WT TET2 తో పోలిస్తే TET2 ఉత్పరివర్తనాలను కలిగి ఉన్న MDS, MDS / MPN మరియు ప్రాధమిక AML రోగులలో పరస్పర సంఘటనల సంఖ్య ఎక్కువగా కనిపిస్తుంది. ఏదేమైనా, రోగి ఎక్సోమ్ విశ్లేషణ నుండి ఈ పరిశీలన అదనపు ఉత్పరివర్తనాలను ప్రోత్సహించడంలో TET2 ఉత్పరివర్తనాల యొక్క ప్రత్యక్ష పాత్రను సూచించదు, ఎందుకంటే TET2 ఉత్పరివర్తనాలతో బాధపడుతున్న రోగులతో సంబంధం ఉన్న ఇతర కారకాలు ఈ పరిశీలనకు వృద్ధాప్యం, పెరిగిన మూల కణాల విస్తరణ మరియు / లేదా క్లోనల్ హేమాటోపోయిసిస్ యొక్క మునుపటి దశ కారణంగా ఎక్కువ సగటు వ్యాధి జాప్యం. మెట్టేషన్ సముపార్జనలకు పెరిగిన అవకాశం TET2- లోపం ఉన్న HSC లు / HPC లలో మరింత వేగవంతం అవుతుంది, ఎందుకంటే Tet2 నష్టం ఈ కణాలలో అంతర్గత మార్పులను ప్రేరేపించింది, పెరిగిన స్వీయ-పునరుద్ధరణ మరియు విస్తరణతో. మా అధ్యయనం Tet2 - / - ఎలుకలలోని విభిన్న వ్యాధి సమలక్షణాల యొక్క వ్యాధికారకంలో చిక్కుకున్న జన్యువులపై ఉత్పరివర్తనాలను గుర్తించింది. Tet2 - / - లోని నాచ్ 1 , Flt3 , Nf1 , Ebf1 , Apc , Cbl మరియు ఇతర జన్యువులలోని ఉత్పరివర్తనలు మానవ హేమాటోలాజికల్ ప్రాణాంతక జన్యు మార్పులకు అనుగుణంగా ఉంటాయి 20, 21, 22, 23, 24 . క్లోనల్ హేమాటోపోయిసిస్ 13 ఉన్న ఆరోగ్యకరమైన వృద్ధులలో కూడా TET2 ఉత్పరివర్తనలు జరుగుతాయని ఇటీవలి అధ్యయనాలు చూపించాయి. అందువల్ల, హేమాటోలాజికల్ ప్రాణాంతకత మరియు వృద్ధులలో పూర్వీకుల సంఘటనగా, TET2 ఉత్పరివర్తనలు HSC లు / HPC ల యొక్క క్లోనల్ విస్తరణ యొక్క ప్రారంభ దశలలో జోక్యం చేసుకోవడానికి తగిన లక్ష్యాన్ని సూచిస్తాయి.

HSC లు / HPC లు 19 లో మైలోయిడ్ ట్యూమర్-అణిచివేసే పనితీరుకు TET2 యొక్క ఉత్ప్రేరక చర్య అవసరమని మేము చూపించినప్పటికీ, మా ఇటీవలి RNA-seq మరియు 5mC / 5hmC విశ్లేషణలు ప్రీమాలిగ్నెంట్ Tet2 - / - మరియు WT LK కణాలు ప్రత్యేకమైన సైటోసిన్ మార్పులను చూపించాయి (ముఖ్యంగా 5 హెచ్‌ఎంసి) టెట్ 2 - / - ఎల్‌కె కణాలలో నిర్దిష్ట జన్యువులను వాటి వ్యక్తీకరణను మార్చకుండా గుర్తించండి. జన్యువులో 5 ఎంసి యొక్క ఆక్సీకరణ మరియు డీమిథైలేషన్ అధునాతన పద్ధతిలో నియంత్రించబడతాయి. 5fC మరియు 5caC TDG 1, 29 కు సబ్‌స్ట్రేట్‌లు. TET లు మరియు TDG 5mC యొక్క ఆక్సీకరణ మరియు DNA లో 5fC / 5caC యొక్క ఎక్సిషన్ ద్వారా క్రియాశీల DNA డీమెథైలేషన్‌ను ప్రారంభిస్తాయి, తరువాత అబాసిక్ సైట్ (AP సైట్) యొక్క కోత మరియు మరమ్మత్తు. BER ప్రక్రియ చాలా ఖచ్చితమైనది అయినప్పటికీ, 5mC ఉత్పన్నాలలో ప్రతిరూపం కారణంగా మరియు గ్యాప్ ఫిల్లింగ్ సమయంలో పాలిమరేస్ లోపాల వల్ల లోపాలు సంభవించవచ్చు. వాస్తవానికి, ఇటీవలి విట్రో బయోకెమికల్ అధ్యయనం ప్రకారం, DNA డబుల్-స్ట్రాండ్ విరామాలను నివారించడానికి TET1 మరియు TDG సిమెట్రిక్లీ మిథైలేటెడ్ CpG ల యొక్క సీక్వెన్షియల్ డీమిథైలేషన్‌ను మధ్యవర్తిత్వం చేస్తాయి, ఇవి కణాలను 30 చంపగలవు లేదా మార్చగలవు. 5mC కణితి కణాలలో ఒక ఉత్పరివర్తనంగా కనుగొనబడింది 31 . అదనంగా, 'G'-5caC బేస్ జతలు DNA ప్రతిరూపణ 32 సమయంలో అసమతుల్యతను అనుకరిస్తాయని తాజా నివేదిక కనుగొంది. అందువల్ల, జన్యుసంబంధమైన 5 ఎంసి ఉత్పన్నాలు సాధారణంగా BER చేత లోపం లేకుండా ప్రాసెస్ చేయబడాలి, అసమతుల్య మరమ్మత్తు DNA ప్రతిరూపణ సమయంలో కొన్ని 5mC ఆక్సీకరణ ఉత్పన్నాలకు 'బ్యాకప్'గా ఉపయోగపడుతుంది.

ఉత్పరివర్తనలు సాధారణంగా జన్యువు అంతటా యాదృచ్ఛికంగా సంభవిస్తాయి. Tet2 - / - కణితుల ఉత్పరివర్తనాలలో బహిరంగ బేస్ ప్రాధాన్యతను మేము గమనించనప్పటికీ , ఉత్పరివర్తనలు CpG సైట్‌లకు దగ్గరగా ఉంటాయి. TET2 - / - కణితుల్లో 5hmC లాభంతో లోకి వద్ద గణనీయంగా ఎక్కువ ఉత్పరివర్తనలు సంభవించాయని మా అధ్యయనం నిరూపించింది, ఇక్కడ TET2 సాధారణంగా బంధిస్తుంది. సంపాదించిన -5 హెచ్‌ఎంసి సైట్ల వద్ద / చుట్టూ పెరిగిన స్థానిక మ్యుటేషన్ రేట్లతో టెట్ 2 నష్టం యొక్క అనుబంధాన్ని నియంత్రించే విధానాలు నిర్ణయించబడుతున్నాయి. ఇటీవలి అధ్యయనం ప్రకారం Ung - / - ఎలుకలు అధిక ఆకస్మిక మ్యుటేషన్ రేట్లను ప్రదర్శిస్తాయి మరియు ఆకస్మిక B- సెల్ లింఫోమాస్ 33 లో పెరుగుతాయి. ఇంకా, Mbd4 - / - ఎలుకలు ఇటీవల CpG సైట్లు 34 వద్ద C-to-T పరివర్తనాల రేట్లు పెరిగినట్లు వర్గీకరించబడ్డాయి. ఈ నేపథ్యంలో, మా అధ్యయనాలు TET2 నష్టం మరియు TET2 నష్ట-మధ్యవర్తిత్వం కలిగిన 5mC ఆక్సీకరణ డైస్రెగ్యులేషన్ నిర్దిష్ట జన్యు స్థానంలో పెరిగిన ఉత్పరివర్తనంతో సంబంధం కలిగి ఉన్నాయని సూచిస్తున్నాయి. అందువల్ల, TET2 HSC / HPC జన్యువులను ఉత్పరివర్తనానికి వ్యతిరేకంగా రక్షిస్తుంది. 5fC మరియు 5caC 35, 36, 37 లకు ఇప్పుడు జన్యుసంబంధమైన ప్రొఫైలింగ్ పద్ధతులు ఉన్నాయి. క్రియాశీల డీమిథైలేషన్ సమయంలో 5fC మరియు 5caC నేరుగా TDG / BER చేత మినహాయించబడినందున, Tet2 - / - లో 5fC మరియు 5caC మార్కులలో మార్పులు ఉన్న సైట్లు అధిక మ్యుటేషన్ రేట్లతో ముడిపడి ఉన్నాయా అనేది ఆసక్తికరంగా ఉంటుంది. Tet2 - / - లో 5mC, 5hmC, 5fC మరియు 5caC యొక్క సమాంతర, జన్యు-విస్తృత, బేస్-రిజల్యూషన్ పటాలు మరియు WT LK కణాలు HSC లు / HPC లలో TET2- మధ్యవర్తిత్వ జన్యు-విస్తృత DNA డీమెథైలేషన్ డైనమిక్స్‌ను విడదీయడానికి మరియు నిర్దిష్ట మధ్య పరస్పర సంబంధాలను వెలికితీసేందుకు హామీ ఇవ్వబడతాయి. 5mC, 5hmC, 5fC లేదా 5caC మార్పులు మరియు Tet2 నష్టం వలన కలిగే జన్యుసంబంధ హైపర్‌ముటాజెనిసిటీ . నిజమే, మా ఫలితాలకు అనుగుణంగా, ఇటీవలి నివేదిక TET1 లేదా 3 కన్నా ఎక్కువ, TET2 యొక్క బలము 5hmC 38 యొక్క మరింత ఆక్సీకరణం అని రుజువునిస్తుంది.

సారాంశంలో, TET2 నష్టం HSC లు / HPC లలో హైపర్‌ముటాజెనిసిటీకి దారితీస్తుందని మేము చూపిస్తాము, TET2 యొక్క నష్టంపై 5hmC లాభంతో లోకి వద్ద ప్రాధాన్యత ఇవ్వబడుతుంది, ఇక్కడ TET2 సాధారణంగా బంధిస్తుంది. TET2- ఆధారిత 5hmC మార్కులు LK కణాల ఎక్సోన్స్ వంటి జన్యు శరీరాల వద్ద అధికంగా ఉంటాయి. TET2 -deficient HSCs/HPCs that become hypermutagenic are likely not malignant per se , but higher mutation rates in these cells may result in additional driver mutation(s) in TET2 target genes over time. Such states may be amenable to TET2 activity-boosting chemoprevention approaches. Our results unveil a novel role for TET2 in safeguarding genome mutagenicity and provide additional insights into the mechanisms by which loss-of-function TET2 mutations cause diverse human haematological malignancies. Further mechanistic studies are needed to determine how TET2 loss leads to increased DNA mutagenicity in HSCs/HPCs and thus the increased risks of haematopoietic malignancies.

పద్ధతులు

Analyses of mice

Tet2 -knockout ( Tet2 −/− ) mice were generated as described 14 . Animal care was conducted in accordance with institutional guidelines and approved by the Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), University of Miami Miller School of Medicine. PB was collected by retro-orbital bleeding of mice and was smeared for May–Grünwald–Giemsa staining, and/or subjected to an automated blood count (Hemavet System 950FS). For histopathology analyses, femurs were fixed in formaldehyde, decalcified and paraffin embedded. Spleens, livers, lymph nodes, thymus and intestine were treated similarly, except for the decalcification step. Sections (4.5 μm) were stained with haematoxylin and eosin (H&E). For flow cytometric analyses, single-cell suspensions from BM, spleen, liver, lymph node, thymus and PB were stained with panels of fluorochrome-conjugated antibodies. Dead cells were excluded by 4, 6-diamidino-2-phenylindole staining. Analyses were performed using a BD FACSCanto II or LSRII flow cytometer. All data were analysed by FlowJo7.6 software.

Mouse exome sequencing

Initial WES was carried out to identify candidate mutations in the exome of genes. Genomic DNA was captured with the NimbleGen mouse exome array according to the manufacturer's protocol, and 100-bp paired-end sequencing was performed using an Illumina HiSeq 2000. Raw sequencing reads were mapped to the whole mouse genome (mm10) using PEMapper/PECaller (//github.com/wingolab-org/pecaller) with the default settings 39, and variant bases were annotated with SeqAnt (//seqant.genetics.emory.edu/) 40 . For samples subjected to mutation detection, genomic DNA was amplified in selected exons by PCR (primers shown in Supplementary Data 8) and sequenced by Sanger sequencing. The location and types of mutations were then determined by sequencing results.

HPRT mutation analyses

Mutation analyses can be achieved in proliferating cells in vitro by anHPRT1 assay that positively selects for HPRT-deficient mutants based on their resistance to 6-TG, which is lethal to HPRT-WT cells that are proficient in free purine base salvage 41 . The HPRT mutation assay was conducted as described previously 42 . Briefly, cells (5 × 10 5 ) were seeded in triplicate in 10-cm petri dishes for 12 h and fed with complete medium containing 5 μM freshly prepared 6-TG. Plating efficiency was determined by culturing 5 × 10 2 cells in the absence of 6-TG. After 10 days of culturing, colonies were visualized by staining with 0.05% crystal violet. The mutation frequency was then the ratio of the number of clones in the presence of 6-TG to the total number of cells plated, normalized by the plating efficiency. Types of mutations were characterized by DNA sequencing coding regions of the HPRT gene using primers shown in Supplementary Data 8.

రోగులు

The mutational statuses for TET2 and other coexisting genes were analysed in BM and blood specimens from patients with various myeloid neoplasms, including MDS, MDS/MPN and secondary AML (see Supplementary Table 4 and Supplementary Data 5). Informed consent was obtained according to protocols approved by the institutional review boards and in accordance with the Declaration of Helsinki. Diagnosis was confirmed at each institution according to the World Health Organization classification criteria. Analysis of TCGA primary AML cases was performed using publically available data sets (//tcga-data.nci.nih.gov/tcga/tcgaHome2.jsp).

WES for human patient samples

WES and targeted capture sequencing were performed as described previously 43 . For WES, the 50 Mb of protein coding sequences was enriched from total genomic DNA by liquid-phase hybridization using SureSelect (version 4) (Agilent Technology), followed by massively parallel sequencing with HiSequation 2000 (Illumina). Somatic mutations were detected using our in-house pipeline, followed by validation using amplicon deep sequencing 43, 44 . To minimize false positives and focus on the most prevalent or relevant somatic events, we implemented a rational bioanalytic filtering approach and applied heuristic bioanalytic pipelines. We used two independent pipelines to identify somatic and germline alterations. For confirmation of somatic mutations, we analysed paired germline DNA from CD3 + lymphocytes. The selected observations were validated by targeted deep sequencing using MiSeq. Our sequence library for deep sequencing was generated by TruSeqCustom Amplicon (Illumina).

Targeted multiamplicon deep sequencing of patient samples

We applied multiamplicon-targeted deep sequencing (TrueSeq; Illumina) to frequently affected exons of 60 selected genes 45 . The sequencing libraries were generated according to an Illumina paired-end library protocol and subjected to deep sequencing on MiSeq (Illumina) instrumentation according to standard protocol. High-probability oncogenic mutations were called by eliminating sequencing/mapping errors and known/possible single-nucleotide polymorphisms based on available databases and frequencies of variant reads. Genomic copy number status was calculated by directly enumerating corresponding sequencing reads in each exon.

గణాంక విశ్లేషణ

Differences between experimental groups were determined by the Student's t -test, Fisher's exact test, Wilcoxon's rank-sum test and/or analysis of variance, followed by Newman–Keuls multiple comparison tests as appropriate. పి విలువలు <0.05 ముఖ్యమైనవిగా పరిగణించబడ్డాయి. For SNV count data, χ 2 tests were used as implemented in R (//cran.r-project.org/) 46 .

డేటా లభ్యత

Genome-wide data sets generated for this study are deposited at GEO under the accession number GSE74390. All other remaining data are available within the article and Supplementary Files, or available from the authors on request.

అనుబంధ సమాచారం

PDF ఫైళ్లు

  1. 1.

    అనుబంధ సమాచారం

    Supplementary Figures, Supplementary Tables, Supplementary Methods and Supplementary References

ఎక్సెల్ ఫైల్స్

  1. 1.

    అనుబంధ డేటా 1

    aCGH by tumor type.

  2. 2.

    అనుబంధ డేటా 2

    List of the counts of unique variants by Tet2-/- tumor type.

  3. 3.

    అనుబంధ డేటా 3

    List of genes with recurrent SNVs and genes with recurrent missense in Tet2-/- tumors.

  4. 4.

    అనుబంధ డేటా 4

    WES from premalignant young mice.

  5. 5.

    అనుబంధ డేటా 5

    Genome-wide 5hmC distributions in premalignant WT and Tet2-/- LK cells.

  6. 6.

    అనుబంధ డేటా 6

    TET2 ChIP-seq data in MEL cells stably expressing FLAG-mTET2opt.

  7. 7.

    అనుబంధ డేటా 7

    Mutations in TET2-wt and TET2-mut MDS and MDS/MPN patients.

  8. 8.

    అనుబంధ డేటా 8

    Primers used in the study.

వ్యాఖ్యలు

వ్యాఖ్యను సమర్పించడం ద్వారా మీరు మా నిబంధనలు మరియు సంఘ మార్గదర్శకాలకు కట్టుబడి ఉండాలని అంగీకరిస్తున్నారు. మీరు దుర్వినియోగమైనదాన్ని కనుగొంటే లేదా అది మా నిబంధనలు లేదా మార్గదర్శకాలకు అనుగుణంగా లేనట్లయితే దయచేసి దాన్ని అనుచితమైనదిగా ఫ్లాగ్ చేయండి.