మానవ కత్తిరించిన డిస్క్ 1 ప్రోటీన్ల పరస్పర చర్యలు: స్కిజోఫ్రెనియాకు చిక్కులు | అనువాద మనోరోగచికిత్స

మానవ కత్తిరించిన డిస్క్ 1 ప్రోటీన్ల పరస్పర చర్యలు: స్కిజోఫ్రెనియాకు చిక్కులు | అనువాద మనోరోగచికిత్స

Anonim

విషయము

  • వ్యాధి జననం
  • మనోవైకల్యం

నైరూప్య

అనేక జన్యు సంబంధాలు మరియు అసోసియేషన్ నివేదికలు మానసిక అనారోగ్యంలో డిస్ట్రప్డ్ -ఇన్-స్కిజోఫ్రెనియా ( DISC1 ) జన్యువును సూచించాయి . సి-టెర్మినస్-కత్తిరించబడిన ప్రోటీన్‌ను ఎన్కోడ్ చేస్తామని అంచనా వేసిన స్కాటిష్ కుటుంబ ట్రాన్స్‌లోకేషన్, మానసిక రుగ్మతల యొక్క పాథోఫిజియాలజీలో చిన్న ఐసోఫామ్‌ల ప్రమేయాన్ని సూచిస్తుంది. మేము ఇటీవల DISC1 జన్యువు కోసం సంక్లిష్టమైన ప్రత్యామ్నాయ స్ప్లికింగ్ నమూనాలను నివేదించాము మరియు స్కిజోఫ్రెనియాతో బాధపడుతున్న రోగుల మెదడుల్లో మరియు ప్రమాద-అనుబంధ యుగ్మ వికల్పాల యొక్క క్యారియర్‌లలో చిన్న ఐసోఫామ్‌లు అతిగా ఒత్తిడి చేయబడుతున్నాయని కనుగొన్నాము. ప్రత్యామ్నాయ DISC1 ఐసోఫామ్‌ల యొక్క ప్రోటీన్-ప్రోటీన్ పరస్పర చర్యలపై పరిశోధన మానసిక అనారోగ్యంలో కత్తిరించబడిన రూపాల యొక్క అతిగా ప్రసరణ యొక్క క్రియాత్మక పరిణామాల గురించి సమాచారాన్ని అందిస్తుంది. మానవ పిండ మూత్రపిండాల (HEK293) కణాలు మానవ ఎపిటోప్-ట్యాగ్ చేయబడిన DISC1 వేరియంట్‌లతో మరియు ఎపిటోప్-ట్యాగ్ చేయబడిన NDEL1, FEZ1, GSK3β మరియు PDE4B నిర్మాణాలతో సహ-బదిలీ చేయబడ్డాయి. కత్తిరించబడిన అన్ని DISC1 వేరియంట్లు పూర్తి-నిడివి DISC1 తో కాంప్లెక్స్‌లను ఏర్పరుస్తాయని కో-ఇమ్యునోప్రెసిపిటేషన్ అస్సేస్ నిరూపించింది. చిన్న DISC1 స్ప్లైస్ వేరియంట్లు LΔ78, LΔ3 మరియు Esv1 NDEL1 మరియు PDE4B ప్రోటీన్లతో తగ్గినట్లు లేదా కట్టుబడి ఉండవని చూపించాయి, కానీ FEZ1 మరియు GSK3β లతో పూర్తిగా సంకర్షణ చెందాయి. జీవితకాలమంతా మానవ పోస్ట్‌మార్టం కణజాలంలో GSK3β యొక్క తాత్కాలిక వ్యక్తీకరణ నమూనా కత్తిరించబడిన DISC1 వేరియంట్‌లతో సమానంగా ఉంటుంది, ఇది మానవ మెదడులోని ఈ ప్రోటీన్ల మధ్య పరస్పర చర్యల అవకాశాన్ని సూచిస్తుంది. కత్తిరించిన DISC1 వేరియంట్‌లతో పూర్తి-నిడివి DISC1 యొక్క సముదాయాలు DISC1 ఫంక్షన్‌కు కీలకమైన సెల్యులార్ ఆటంకాలకు దారితీయవచ్చని మా ఫలితాలు సూచిస్తున్నాయి.

పరిచయం

డిస్ట్రప్టెడ్-ఇన్-స్కిజోఫ్రెనియా 1 ( DISC1 ) జన్యువు స్కిజోఫ్రెనియా (SZ) మరియు మానసిక సమలక్షణాలతో అనుసంధానించబడి ఉంది, ఇది అనేక జన్యుసంబంధ అనుసంధానం మరియు అసోసియేషన్ అధ్యయనాలలో ఉంది. మానసిక అనారోగ్య చరిత్ర కలిగిన స్కాటిష్ కుటుంబంలో సమతుల్య క్రోమోజోమ్ ట్రాన్స్‌లోకేషన్ (1; 11) యొక్క ఆవిష్కరణ నుండి అసలు అన్వేషణ ఉద్భవించింది. ఈ ట్రాన్స్‌లోకేషన్ DISC1 ప్రోటీన్ యొక్క సి-టెర్మినస్ భాగాన్ని కత్తిరించడానికి దారితీస్తుంది. DISC1 పరంజా ప్రోటీన్‌గా పనిచేస్తుంది, న్యూరో డెవలప్‌మెంట్, సెంట్రోసోమ్ మరియు మైక్రోటూబ్యూల్ ఓరియంటేషన్, సిగ్నల్ ట్రాన్స్‌డక్షన్ మరియు న్యూరైట్ పెరుగుదల వంటి ప్రోటీన్లతో కాంప్లెక్స్‌లను ఏర్పరుస్తుంది. అందువల్ల, DISC1 యొక్క కత్తిరించడం సెల్యులార్ పనితీరును ప్రభావితం చేస్తుంది, మెదడు అభివృద్ధిని మారుస్తుంది మరియు ప్రవర్తనా మార్పులకు దారితీస్తుంది.

DISC1 కత్తిరించడం యొక్క జీవ పరిణామాలు మరియు SZ కు గురికావడానికి వాటి యొక్క చిక్కులు వివిధ hyp హాత్మక నిర్మాణాలను ఉపయోగించి మునుపటి అనేక అధ్యయనాలలో పరిశీలించబడ్డాయి. కణ సంస్కృతిలో, కత్తిరించబడిన ఉత్పరివర్తన DISC1 సెల్యులార్ పంపిణీని పంక్టేట్ పెరిన్యూక్లియర్ నమూనా నుండి సైటోప్లాస్మిక్ వ్యక్తీకరణకు విస్తరిస్తుంది. SZ మరియు బైపోలార్ డిజార్డర్ ఉన్న రోగుల ఆర్బిటోఫ్రంటల్ కార్టెక్స్ యొక్క సెల్ న్యూక్లియస్లో చిన్న DISC1 ప్రోటీన్ యొక్క సుసంపన్నతను ఉపకణ భిన్నం చూపిస్తుంది. PC-12 కణాలలో ఉత్పరివర్తన DISC1 యొక్క వ్యక్తీకరణ పొడిగింపు మరియు మొత్తం న్యూరైట్ సంఖ్యను తగ్గిస్తుంది. [4] ఇంకా, జంతు నమూనాలు స్కాటిష్ కుటుంబ బదిలీని అనుకరించాయి. DISC1 ఉత్పరివర్తనాలతో ట్రాన్స్జెనిక్ ఎలుకల ప్రవర్తనా అసాధారణతలు SZ మరియు / లేదా ఇతర న్యూరోసైకియాట్రిక్ రుగ్మతలను గుర్తుకు తెస్తాయి. 5, 6, 7

మానవ DISC1 జన్యువు కత్తిరించబడిన DISC1 ప్రోటీన్లలోకి అనువదించబడిన అనేక ఐసోఫామ్‌లను ఎన్కోడ్ చేస్తుందని మేము ఇటీవల ప్రదర్శించాము. ముఖ్యముగా, ఈ ప్రత్యామ్నాయంగా స్ప్లిస్డ్ ట్రాన్స్క్రిప్ట్స్ యొక్క వ్యక్తీకరణ SZ ఉన్న రోగుల హిప్పోకాంపస్లో మరియు మానసిక రుగ్మతలకు ఎక్కువ ప్రమాదంతో సంబంధం ఉన్న యుగ్మ వికల్పాలను మోసే వ్యక్తులలో పెరుగుతుంది. [8] అంతేకాక, కత్తిరించిన వైవిధ్యాలు ఇతర ప్రసవానంతర వయస్సులతో పోలిస్తే పిండం సెరిబ్రల్ కార్టెక్స్‌లో ప్రాధాన్యత వ్యక్తీకరణను చూపుతాయి, అభివృద్ధి చెందుతున్న మెదడులో వారి పాత్రను సూచిస్తాయి.

SZ ఉన్న రోగులలో సమృద్ధిగా ఉన్నట్లు నిర్ధారించబడిన DISC1 స్ప్లైస్ వేరియంట్ల యొక్క పరస్పర చర్యలను పరిశోధించడానికి ఇది మొదటి అధ్యయనం. మేము పూర్తి-నిడివి DISC1 తో మరియు న్యూరైట్ ఆర్కిటెక్చర్, సెంట్రోసోమ్ మరియు మైక్రోటూబ్యూల్ పొజిషనింగ్, అలాగే cAMP సిగ్నలింగ్‌తో సహా క్లిష్టమైన అభివృద్ధి ప్రక్రియలను నియంత్రించే భాగస్వాములతో వారి పరస్పర చర్యలను పరిశీలించాము. FEZ1, NDEL1, PDE4B మరియు GSK3β వారి సెల్యులార్ ఫంక్షన్ ప్రాముఖ్యత మరియు సంపూర్ణ బైండింగ్-సైట్ క్యారెక్టరైజేషన్, 4, 9, 10 మరియు SZ లో వారి ప్రమేయం కారణంగా ఎంపిక చేయబడ్డాయి. 11, 12, 13 సంకర్షణ సైట్లు లేకపోవడం లేదా పూర్తి-నిడివి గల DISC1 తో పోల్చితే నవల వైవిధ్యాల యొక్క త్రిమితీయ నిర్మాణాలలో మార్పులు కారణంగా ఈ భాగస్వాములను చిన్న DISC1 ఐసోఫామ్‌లతో బంధించడం మార్చవచ్చని మేము hyp హించాము. దీనికి విరుద్ధంగా, చిన్న ట్రాన్స్‌క్రిప్ట్‌లు బైండింగ్ సామర్థ్యాలను కలిగి ఉంటే, SZ ను అభివృద్ధి చేసే విషయాల మెదడుల్లో వాటి అధిక ప్రసరణ సిగ్నలింగ్ ప్రక్రియల యొక్క అనుచిత క్రియాశీలతకు దారితీయవచ్చు. చిన్న-వేరియంట్‌లకు పూర్తి-నిడివి గల DISC1 తో కాంప్లెక్స్‌లను రూపొందించే సామర్థ్యం ఉందా అని కూడా మేము పరిశీలించాము, అవి జరిగితే, అవి NDEL1 మరియు ఇతర భాగస్వాములతో బంధించడానికి ముఖ్యమైన పూర్తి-నిడివి హోమోడైమర్‌లు / మల్టీమర్‌ల ఏర్పాటుకు ఆటంకం కలిగిస్తాయని hyp హించారు. 14

ఈస్ట్ టూ-హైబ్రిడ్ అధ్యయనాల నుండి సంక్లిష్టమైన DISC1 ఇంటరాక్షన్ నెట్‌వర్క్ ప్రతిపాదించబడింది, 2, 15 మరియు ప్రోటీన్ ఇంటరాక్టర్లను వివరించడానికి సెల్ లైన్లు మార్చబడిన DISC1 యొక్క కత్తిరించబడిన సంస్కరణలతో మార్చబడ్డాయి. కత్తిరించబడిన అన్ని DISC1 ఐసోఫాంలు, Esv1, LΔ3, LΔ78T9 మరియు LΔ78T10, పూర్తి-నిడివి DISC1 తో పాటు FEZ1 మరియు GSK3β లతో కట్టుబడి ఉన్నాయని మేము కనుగొన్నాము, అయితే ఇతర భాగస్వాములతో పరస్పర చర్యలు బలహీనపడతాయి. SZ ఉన్న రోగుల మెదడుల్లో అతిగా ఒత్తిడి చేయబడిన కత్తిరించబడిన DISC1 ట్రాన్స్‌క్రిప్ట్‌లకు GSK3β ఒక బంధన లక్ష్యంగా ఉంటుందని కోఎక్స్‌ప్రెషన్ విశ్లేషణ సూచిస్తుంది. ఈ డేటా ప్రత్యేకమైన ప్రోటీన్ కాంప్లెక్స్‌లను రూపొందించడంలో DISC1 స్ప్లైస్ వేరియంట్ల పాత్రను హైలైట్ చేస్తుంది మరియు అవి మానసిక అనారోగ్యానికి ప్రమాదాన్ని అందించే విధానాలను సూచిస్తాయి.

సామాగ్రి మరియు పద్ధతులు

ప్లాస్మిడ్ DISC1 cDNA వేరియంట్‌లతో కల్చర్డ్ HEK293 కణాల బదిలీ మరియు NDEL1, PDE4B, GSK3β మరియు FEZ1

మానవ పిండ మూత్రపిండ (HEK293) సెల్ లైన్ బదిలీకి ముందు 24 గంటలకు 6 × 10 5 కణాల చొప్పున కల్చర్ చేయబడింది. DISC1 cDNA వైవిధ్యాలు క్షీరద వ్యక్తీకరణ వెక్టర్ pCMV-SC-NM లో NDEL1 (ట్రాన్స్క్రిప్ట్ వేరియంట్ 1; NM_001025579.1), PDE4B1 (ఐసోఫార్మ్ 1; NM_002600.3), GSK3β ఐసోఫార్మ్ 1 కొరకు N- టెర్మినల్ మైక్ లేదా FLAG ట్యాగ్‌ను కలిగి ఉన్నాయి. NM_002093.3), FEZ1 (ట్రాన్స్క్రిప్ట్ వేరియంట్ 1; NM_005103.4) మరియు DISC1-DISC1 అసోసియేషన్ (స్ట్రాటజేన్, లా జోల్లా, CA, USA). గతంలో వర్గీకరించబడిన స్ప్లైస్ వేరియంట్లు DISC1L (ఎక్సోన్స్ 1–13), ఎల్వి (ఎక్సోన్స్ 1–13), ఎస్ మరియు నవల వేరియంట్లు ఎస్వి 1 (ఎక్సాన్ 3 వద్ద చొప్పించడం; యాక్సెషన్ ఐడి ఎఫ్‌జె 804213), ఎల్ 78 టి 9 (ఎక్సోన్స్ 7 మరియు 8 తొలగింపు, ఎక్సాన్ 9 వద్ద ముగింపు; ప్రవేశ ID FJ804202), LΔ78T10 (ఎక్సాన్ 10 వద్ద ముగింపు; ప్రవేశ ID FJ804188) మరియు LΔ3 (ఎక్సాన్ 3 యొక్క తొలగింపు; ప్రవేశ ID: FJ804212) బదిలీ చేయబడ్డాయి (మూర్తి 1a). కణాలు sonicated మరియు మంచు మీద 15 నిమిషాలు పొదిగేవి. బ్రాడ్‌ఫోర్డ్ పద్ధతి ద్వారా ప్రోటీన్ గా ration తను పరిశీలించారు.

Image

( ) ఎపిటోప్-ట్యాగ్ చేయబడిన DISC1 నిర్మాణాలు. ఎపిటోప్-ట్యాగ్ చేయబడిన స్కీమాటిక్ ప్రాతినిధ్యం HEK293 కణాలలో కలిసి ఉంటుంది. నిరంతర రేఖ దీర్ఘచతురస్రాలుగా చూపబడిన సంఖ్యా ఎక్సోన్‌లతో DISC1 యొక్క జన్యు శ్రేణిని సూచిస్తుంది. అన్ని DISC1 నిర్మాణాలకు N- టెర్మినల్ మైక్ మరియు / లేదా FLAG ఎపిటోప్ జోడించబడింది. తెలిసిన DISC1 (L, Lv మరియు S) మరియు 'DISC1 LΔ78T10' (ఎక్సోన్స్ 7 మరియు 8 యొక్క తొలగింపు; ఎక్సాన్ 10 వద్ద ముగింపు), DISC1 LΔ78T9 (ఎక్సోన్స్ 7 మరియు 8 తొలగింపు; ఎక్సాన్ 9 వద్ద ముగింపు), DISC1 LΔ3 (DISC1 LΔ3) ఎక్సాన్ 3 యొక్క తొలగింపు) మరియు ఎస్వి 1 (ఎక్సాన్ 3 లో చొప్పించడం) ఉపయోగించబడ్డాయి. ( బి ) DISC1 స్వీయ-అనుబంధం. చిన్న ఐసోఫాంలు పూర్తి-నిడివి DISC1 తో బంధిస్తాయి. అన్ని FLAG- ట్యాగ్ చేయబడిన DISC1 ఐసోఫామ్‌లు (Lv, LΔ3, LΔ78T10, LΔ78T9, S మరియు Esv1) మైక్-ట్యాగ్ చేయబడిన, పూర్తి-నిడివి గల DISC1 (L) తో సహ-ఇమ్యునోప్రెసిపిటేట్. అవక్షేపణ ప్రోటీన్లు SDS-PAGE పై పరిష్కరించబడ్డాయి మరియు FLAG DISC1 కు వ్యతిరేకంగా యాంటీబాడీతో ఇమ్యునోబ్లోట్ చేయబడ్డాయి. N = 4 ప్రత్యేక ప్రయోగాలు. ( సి మరియు ) కో-ఇమ్యునోప్రెసిపిటేషన్‌లో ఉపయోగించే ఇన్‌పుట్‌లు. ప్రయోగంలో ఉపయోగించిన లైసెట్లు నేరుగా ఇమ్యునోప్రెసిపిటేటెడ్ ప్రోటీన్లతో సమాంతరంగా SDS-PAGE కి లోబడి ఉన్నాయి. యాంటీ-ఫ్లాగ్ మరియు మైక్ ఇమ్యునోబ్లోట్స్ ఇన్పుట్స్ పోల్చదగిన ప్రోటీన్ వ్యక్తీకరణను ఇమ్యునోప్రెసిపిటేషన్ సమయంలో మరియు band హించిన పరమాణు బరువులు వద్ద బ్యాండ్లను చూపుతాయి. ( డి ) కత్తిరించిన DISC1 ప్రోటీన్ల యొక్క అవకలన పరస్పర చర్యలు. చిన్న-ఐసోఫామ్‌లతో పరస్పర చర్య కోసం పూర్తి-నిడివి DISC1 (L) తో సంకర్షణ చెందడానికి అవసరమైన ప్రోటీన్లు పరిశీలించబడ్డాయి. FLAG- ట్యాగ్ చేయబడిన DISC1- ఇంటరాక్టర్లతో మైక్-ట్యాగ్ చేయబడిన DISC1 ఐసోఫామ్‌ల కో ఎక్స్ప్రెషన్ తరువాత, లైసేట్లను యాంటీ-మైక్ DISC1 తో ఇమ్యునోప్రెసిపిటేషన్‌కు గురిచేసి, యాంటీ-ఫ్లాగ్ యాంటీబాడీతో ఇమ్యునోబ్లోట్ చేశారు. మొదటి ప్యానెల్: అన్ని DISC1 ఐసోఫాంలు FEZ1 ను బంధిస్తాయి. రెండవ ప్యానెల్: GSK3B తో DISC1 ఐసోఫామ్స్ కో-ఇమ్యునోప్రెసిపిటేట్. మూడవ ప్యానెల్: DISC1L మరియు Lv NDEL1 తో సంకర్షణ చెందుతాయి. నాల్గవ ప్యానెల్: DISC1LΔ3 మరియు LΔ78 PDE4B తో తగ్గిన బైండింగ్‌ను చూపుతాయి. N = 3–4 ప్రత్యేక ప్రయోగాలు. ( ఎఫ్ ) DISC1 స్వీయ-సంఘాల పరిమాణం. ఇమ్యునోప్రెసిపిటేటెడ్ బ్యాండ్ల యొక్క డెన్సిటోమెట్రీ రీడింగులను పూర్తి-నిడివి DISC1L కు సాధారణీకరించారు. సంఖ్యలు కో-ఎక్స్‌ప్రెస్డ్ DISC1 ఐసోఫామ్‌లను సూచిస్తాయి (1: DISC1 Lv, 2: DISC1 LΔ3, 3: DISC1 LΔ78T10, 4: DISC1 LΔ78T9, 5: DISC1 S మరియు DISC1 Esv1). ( g ) FEZ1, GSK3β, PDE4B మరియు NDEL1 లతో DISC1 పరస్పర చర్యల పరిమాణం. ఇమ్యునోప్రెసిపిటేటెడ్ బ్యాండ్ల యొక్క డెన్సిటోమెట్రీ రీడింగులను ఇన్పుట్ బ్యాండ్లకు ఈ క్రింది విధంగా సాధారణీకరించారు; DISC1L, 2: DISC1 Lv, 3: DISC1 LΔ3, 4: DISC1 LΔ78T10, 5: DISC1 LΔ78T9, 6: DISC1 S మరియు 7: DISC1 Esv1. లోపం పట్టీలు sd ని చూపిస్తాయి మరియు P <0.05 వద్ద ఆస్టరిస్క్‌లు ఇవ్వబడ్డాయి.

పూర్తి పరిమాణ చిత్రం

ఇమ్యునోప్రెసిపిటేషన్

లైసేట్స్ (100 μg ప్రోటీన్) యాంటీ-మైక్ యాంటీబాడీస్ (నమూనాకు 2 μg; మిల్లిపోర్, బిల్లెరికా, MA, USA) తో రాత్రిపూట 4. C వద్ద పొదిగేవారు. ప్రోటీన్ జి-ప్లస్ అగరోజ్ పూసలతో (నమూనాకు 25 μl; శాంటా క్రజ్ బయోటెక్నాలజీ, ఇంక్., శాంటా క్రజ్, సిఎ, యుఎస్ఎ) 2 ° 4. C వద్ద పొదిగించడం ద్వారా ఇమ్యునోకాంప్లెక్స్ తిరిగి పొందబడ్డాయి. సెంట్రిఫ్యూగేషన్ (4 ° C వద్ద 2 నిమిషానికి 14 000 × g ) మరియు గుళికల నుండి సూపర్నాటెంట్ యొక్క ఆకాంక్ష ద్వారా ఇమ్యునోప్రెసిపిటేట్లు వేరుచేయబడ్డాయి. పూస గుళికలను లిసిస్ బఫర్ (టి-పిఇఆర్, థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్, రాక్‌ఫోర్డ్, ఐఎల్, యుఎస్‌ఎ; 25 m M బైసిన్, 150 m M సోడియం క్లోరైడ్; pH 7.6) తో మూడు నుండి నాలుగు సార్లు కడుగుతారు, సెంట్రిఫ్యూజ్ చేసి నమూనా బఫర్‌లో తిరిగి అమర్చారు.

వెస్ట్రన్ బ్లాట్ విశ్లేషణ

- మెర్కాప్టోఇథనాల్ కలిగిన 4 × లిథియం డోడెసిల్ సల్ఫేట్ (LDS) నమూనా బఫర్‌లో ఒక నమూనాకు 20 μg ప్రోటీన్ లేదా 10 μl ఇమ్యునోప్రెసిపిటెంట్ ఉపయోగించి ఇమ్యునోబ్లోటింగ్ జరిగింది. నుపేజ్ 4–12% బిస్-ట్రిస్ జెల్స్‌పై (ఇన్విట్రోజెన్, కార్ల్స్ బాడ్, సిఎ, యుఎస్‌ఎ) నమూనాలు పరిష్కరించబడ్డాయి, నైట్రోసెల్యులోజ్ పొరలకు బదిలీ చేయబడ్డాయి మరియు 1 గంటకు 0.05% మధ్య 20 మరియు 5% నాన్‌ఫాట్, పొడి పాలు కలిగిన ట్రిస్-బఫర్డ్ సెలైన్‌లో నిరోధించబడ్డాయి. సి-మైక్ మరియు ఫ్లాగ్ ఫ్యూజన్ ప్రోటీన్‌లను గుర్తించడానికి, గుర్రపుముల్లంగి పెరాక్సిడేస్‌తో కలిపిన యాంటీ-మైక్ లేదా ఫ్లాగ్ యాంటీబాడీని టిబిఎస్‌టిఎమ్ (ట్రిస్-బఫర్డ్ సెలైన్ (టిబిఎస్) లో 0.05% మధ్య -20 మరియు 5% నాన్‌ఫాట్ పొడి పాలు) 1 వద్ద కరిగించారు. : 5000 గా ration త మరియు రాత్రిపూట 4. C వద్ద పొదిగేది. కెమిలుమినిసెన్స్ ఉపయోగించి బ్లాట్స్ కడుగుతారు మరియు అభివృద్ధి చేయబడ్డాయి. ఇమేజ్ జె (ఎన్ఐహెచ్, బెథెస్డా, ఎండి, యుఎస్ఎ), ఓపెన్ సోర్స్ ఇమేజ్ ప్రోగ్రామ్ (//imagej.nih.gov/ij/download.html వద్ద లభిస్తుంది) ఉపయోగించి బ్యాండ్ల డెన్సిటోమెట్రీని లెక్కించారు.

కణజాల నమూనాలు

మానసిక-రహిత నియంత్రణల నుండి పొందిన పోస్ట్‌మార్టం మానవ మెదడులను క్లినికల్ బ్రెయిన్ డిజార్డర్స్ బ్రాంచ్ (NIMH) వద్ద మరియు 90-M-0142, NO1 ప్రోటోకాల్స్ కింద నేషనల్ ఇన్స్టిట్యూట్ ఆఫ్ చైల్డ్ హెల్త్ అండ్ హ్యూమన్ డెవలప్‌మెంట్ యొక్క అభివృద్ధి లోపాల కోసం బ్రెయిన్ అండ్ టిష్యూ బ్యాంక్ వద్ద సేకరించారు. -హెచ్‌డి -4-3368, ఎన్‌ఓ 1-హెచ్‌డి -4-3383. ప్రతి కేసులో టాక్సికాలజికల్ విశ్లేషణ జరిగింది. మాక్రోస్కోపిక్ లేదా మైక్రోస్కోపిక్ న్యూరోపాథాలజీ, మాదకద్రవ్యాల వినియోగం, మద్యం దుర్వినియోగం లేదా మానసిక అనారోగ్యానికి సంబంధించిన సాక్ష్యాలు గతంలో వివరించిన విధంగా మినహాయించబడ్డాయి. ప్రిఫ్రంటల్ కార్టెక్స్ (డోర్సోలెటరల్ ప్రిఫ్రంటల్ కార్టెక్స్, BA46 / 9) యొక్క పోస్ట్‌మార్టం కణజాల సజాతీయత 272 సాధారణ నియంత్రణల నుండి పొందబడింది (149 ఆఫ్రికన్ అమెరికన్, 113 కాకేసియన్, 6 హిస్పానిక్ మరియు 4 ఆసియా) గర్భధారణ వయస్సు నుండి 14-20 వారాల వరకు మానవ వృద్ధాప్యం ( n = 38) మరియు పుట్టిన 1 వ రోజు నుండి 78 సంవత్సరాల వరకు ( n = 234). మొత్తం RNA సంగ్రహించబడింది, ఒలిగో డిటి, టి 7 తో రివర్స్ ట్రాన్స్క్రిప్ట్ చేయబడింది మరియు సై 3 ఫ్లోరోసెంట్ డైతో లేబుల్ చేయబడింది. నమూనా RNA లకు సమానంగా చికిత్స చేయబడిన అన్ని నమూనాల నుండి రిఫరెన్స్ RNA పూల్ చేయబడింది మరియు ఇది Cy5 ఫ్లోరోసెంట్ డైతో లేబుల్ చేయబడింది.

ఇల్యూమినా మైక్రోరేస్

ఇల్యూమినా ఒలిగోసెట్ (ఇల్యూమినా, శాన్ డియాగో, CA, USA; HEEBO7) తో NHGRI మైక్రోఅరే కోర్ సౌకర్యం నుండి రెండు రంగుల అనుకూల-మచ్చల శ్రేణులు ఉపయోగించబడ్డాయి. ఎజిలెంట్ స్కానర్ (ఎజిలెంట్, శాంటా క్లారా, సిఎ, యుఎస్ఎ) ఉపయోగించి స్కాన్ చేసిన తరువాత, తీవ్రత డేటాను ఎగుమతి చేయడానికి డీఅర్రే సాఫ్ట్‌వేర్ (ఫెయిర్‌ఫాక్స్, విఎ, యుఎస్ఎ; //www.scanalytics.com) ఉపయోగించబడింది. లీనియర్ స్కేల్‌పై నేపథ్య దిద్దుబాటు తరువాత, లాగ్ 2 నిష్పత్తులు (నమూనా / సూచన) లోస్ దిద్దుబాటును ఉపయోగించి సగటు లాగ్ 2 ఫ్లోరోసెంట్ తీవ్రతలలో సాధారణీకరించబడ్డాయి. సాధారణీకరణ తరువాత, సర్రోగేట్ వేరియబుల్ విశ్లేషణను ఉపయోగించి జన్యు వ్యక్తీకరణ చర్యలపై క్రమబద్ధమైన శబ్దం యొక్క తెలిసిన మరియు తెలియని మూలాల ప్రభావాన్ని తగ్గించడానికి లాగ్ 2 నిష్పత్తులు మరింత సర్దుబాటు చేయబడ్డాయి. విశ్లేషణలో ఉపయోగించిన ప్రోబ్స్ యొక్క స్థానాలు సూచించిన విధంగా ఉన్నాయి: FEZ1 (ID 34517) chr11: 124821043–1248211123, GSK3β (ID 24272) chr3: 121065012–121065081, NDEL1 (ID 5747) chr17: 8279903–83B206 మరియు 5294) chr1: 66030780–66612850.

ఫలితాలు

DISC1 వేరియంట్ల యొక్క స్వీయ-బైండింగ్

పూర్తి-నిడివి DISC1 తో చిన్న వేరియంట్ల యొక్క DISC1 స్వీయ-అసోసియేషన్ ప్రవృత్తిని పరిశోధించడానికి, మైక్-ట్యాగ్ చేయబడిన పూర్తి-నిడివి DISC1 (L) FLAG- ట్యాగ్ చేయబడిన చిన్న వేరియంట్‌లతో కోట్రాన్స్‌ఫెక్ట్ చేయబడింది. అన్ని చిన్న ఐసోఫాంలు పూర్తి-నిడివి DISC1 తో బంధిస్తాయి, ఇమ్యునోప్రెసిపిటేషన్ తర్వాత అంచనా వేసిన పరిమాణాలలో ఉన్న బ్యాండ్లచే సూచించబడుతుంది (మూర్తి 1 బి). సెల్ లైసేట్ల యొక్క ఇన్పుట్లను బ్యాండ్ల యొక్క సరైన పరమాణు బరువును నిర్ధారించే సానుకూల నియంత్రణలుగా ఉపయోగించారు మరియు ప్రయోగంలో పోల్చదగిన ప్రోటీన్ స్థాయిలను ప్రదర్శించారు (మూర్తి 1 సి). ఇన్‌పుట్‌తో పోల్చితే ఇమ్యునోప్రెసిపిటేటెడ్ బ్యాండ్ల యొక్క పరిమాణీకరణ పూర్తి-నిడివి DISC1L (మూర్తి 1f) కు ఐసోఫార్మ్-బైండింగ్ సామర్ధ్యాలలో గణాంక వ్యత్యాసాలను వెల్లడించలేదు. ప్రోటీన్ స్వీయ-అసోసియేషన్ డొమైన్ స్ప్లికింగ్ సమయంలో మార్చబడని ప్రాంతంలో ఉందని లేదా ఈ చిన్న ఐసోఫామ్‌లలో నవల స్వీయ-అసోసియేషన్ సైట్లు ఉన్నాయని ఇది సూచిస్తుంది.

అభివృద్ధి చెందుతున్న ముఖ్యమైన ప్రోటీన్లకు DISC1 వేరియంట్ల బంధం

DISC1 ప్రత్యామ్నాయ స్ప్లికింగ్ యొక్క ఉత్పత్తులు DISC1- బైండింగ్ భాగస్వాములతో సంకర్షణ చెందుతాయో లేదో తెలుసుకోవడానికి, N- టెర్మినస్ FLAG ఎపిటోప్ ట్యాగ్‌ను కలిగి ఉన్న FEZ1, GSK3β, NDEL1 మరియు PDE4B, తెలిసిన (L, Lv, S) మరియు నవల DISC1 స్ప్లైస్ వేరియంట్‌లతో ( Esv1, LΔ 78T9, LΔ 78T10 మరియు LΔ3) N- టెర్మినస్ వద్ద మైక్-ట్యాగ్ కలిగి ఉంటుంది. L మరియు Lv ఐసోఫామ్‌లు మాత్రమే NDEL1 (మొదటి మరియు రెండవ దారులు, మూడవ ఇమ్యునోబ్లోట్, మూర్తి 1 డి) ను బంధిస్తాయి, ఈ బైండింగ్‌కు కార్బాక్సిల్ టెర్మినస్ వద్ద ప్రాంతాలు అవసరమని సూచిస్తున్నాయి. DISC1 Esv1 మరియు DISC1 LΔ78T9 బలహీనంగా కట్టుబడి ఉన్న PDE4B, బ్యాండ్ తీవ్రతలో గణనీయమైన తగ్గింపు ద్వారా సూచించబడింది (మూడవ మరియు ఐదవ దారులు, దిగువ, మూర్తి 1d; 1g లో పరిమాణం). PDE4B / DISC1 సంకర్షణ తగ్గడానికి ఒక రూపాంతర మార్పు లేదా క్లిష్టమైన ప్రోటీన్ భాగం లేకపోవడం దోహదం చేస్తుంది. దీనికి విరుద్ధంగా, అన్ని DISC1 ప్రోటీన్ ఐసోఫాంలు FEZ1 మరియు GSK3β (టాప్ మరియు రెండవ ఇమ్యునోబ్లోట్లు, మూర్తి 1d) తో సహ-ఇమ్యునోప్రెసిపిటేట్ సామర్థ్యాన్ని నిలుపుకున్నాయి, వరుసగా 67 మరియు 47kDa వద్ద బలమైన బ్యాండ్లు సూచించాయి.

మానవ మెదడులో అభివృద్ధి వ్యక్తీకరణ నమూనాలు

కత్తిరించబడిన DISC1 వేరియంట్లు FEZ1, NDEL1, PDE4B మరియు GSK3β లతో తాత్కాలికంగా కలిసి ఉన్నాయా అని పరిశీలించడానికి, మానసిక-కాని వ్యక్తుల ప్రిఫ్రంటల్ కార్టెక్స్‌లో జీవితకాలమంతా వ్యక్తీకరణ స్థాయిలు అంచనా వేయబడ్డాయి. పిండం కాలంలో FEZ1, NDEL1 మరియు PDE4B తక్కువ స్థాయిలో వ్యక్తీకరించబడ్డాయి, తరువాత క్రమంగా వ్యక్తీకరణ పెరుగుదల మరియు యువ యుక్తవయస్సులో గరిష్ట స్థాయి (గణాంకాలు 2a, c మరియు d). వారి వ్యక్తీకరణ చిన్న DISC1 ట్రాన్స్క్రిప్ట్స్ యొక్క వ్యక్తీకరణతో ప్రతికూలంగా సంబంధం కలిగి ఉంది ( r −0.18 నుండి .50.51, P <0.001 వరకు). దీనికి విరుద్ధంగా, HEK293 కణ వ్యవస్థలోని అన్ని చిన్న DISC1 ఐసోఫామ్‌లను బంధించే GSK3β, పిండం వయస్సులో బాగా వ్యక్తీకరించబడింది మరియు పుట్టిన తరువాత నెమ్మదిగా క్షీణించింది (మూర్తి 2 బి). జీవితకాలం అంతటా GSK3β యొక్క వ్యక్తీకరణ అన్ని చిన్న DISC1 ట్రాన్స్‌క్రిప్ట్‌లతో గణనీయంగా మరియు సానుకూలంగా సంబంధం కలిగి ఉంది; DISC1 LΔ78 ( r = 0.37; P = 9 × 10 −9 ), LΔ3 ( r = 0.28; P = 2 × 10 −5 ) మరియు Esv1 ( r = 0.2; P = 0.001). ఈ ఫలితాలు GSK3β DISC1 యొక్క కత్తిరించబడిన వేరియంట్‌లతో సంభాషించే సామర్థ్యాన్ని కలిగి ఉన్నాయని సూచిస్తున్నాయి, ప్రత్యేకించి ప్రారంభ అభివృద్ధి సమయంలో అవి రెండూ సాపేక్షంగా అధిక స్థాయిలో వ్యక్తమవుతాయి.

Image

జీవితకాలం అంతటా DISC1- బైండింగ్ భాగస్వాముల యొక్క mRNA వ్యక్తీకరణ. FEZ1 ( a ), GSK3β ( b ), NDEL1 ( c ) మరియు PDE4B ( d ) mRNA యొక్క వ్యక్తీకరణను మానవ-డోర్సోలెటరల్ ప్రిఫ్రంటల్ కార్టెక్స్‌లో జీవితకాలం అంతటా కస్టమ్-స్పాటెడ్ ఇల్యూమినా మైక్రోరేలను ఉపయోగించి కొలుస్తారు. ప్రతి చుక్క లాగ్ 2 (నమూనా / సూచన) గా నివేదించబడిన వ్యక్తిగత విషయం యొక్క వ్యక్తీకరణ స్థాయిని సూచిస్తుంది. X అక్షం పిండం వారాలలో లేబుల్ చేయబడింది, (14-20) తరువాత సంవత్సరాల్లో ప్రసవానంతర జీవితం (0–80). వ్యక్తీకరణ పథం (బ్లూ లైన్) వ్యక్తీకరణ డేటా యొక్క వదులుగా అమర్చడాన్ని సూచిస్తుంది.

పూర్తి పరిమాణ చిత్రం

చర్చా

DISC1 యొక్క చిన్న ట్రాన్స్క్రిప్ట్ వైవిధ్యాలు పూర్తి-నిడివి DISC1 మరియు DISC1 ఫంక్షన్ మరియు న్యూరో డెవలప్‌మెంట్‌కు సమగ్రమైన అనేక ప్రోటీన్‌లను కలిగి ఉన్నాయా అని మేము పరిశీలించాము. ఆశ్చర్యకరంగా, అన్ని చిన్న వైవిధ్యాలు పూర్తి-నిడివి DISC1 తో బంధించబడుతున్నాయని మేము కనుగొన్నాము, అయినప్పటికీ స్వీయ-అనుబంధ మూలాంశాలు అమైనో ఆమ్లాల 403–504, 18 చుట్టూ ఉన్నాయని నమ్ముతారు, ఇవి LΔ3 మరియు Esv1 వేరియంట్లలో లేవు (మూర్తి 3). మునుపటి ఇన్ విట్రో అధ్యయనాలు సూచించినట్లుగా, కత్తిరించబడిన మరియు పూర్తి-నిడివి గల DISC1 యొక్క పనితీరు అసమర్థమైన పనితీరుకు దారితీస్తుంది, ఇందులో పనిచేయని ఉపకణ స్థానికీకరణ మరియు సెంట్రోసోమల్ ధోరణి ఉన్నాయి, [ 10] రోగులలో అతిగా ఒత్తిడి చేయబడిన చిన్న వైవిధ్యాల ద్వారా పూర్తి-నిడివి DISC1 ను సీక్వెస్టరింగ్ చేయడం ఒక యంత్రాంగం కావచ్చు ఈ ప్రోటీన్లు మానసిక రుగ్మతలలో వారి రోగలక్షణ పాత్రను ప్రదర్శిస్తాయి.

Image

కత్తిరించిన DISC1 ప్రోటీన్ల బైండింగ్ సైట్లు icted హించబడ్డాయి. మునుపటి అధ్యయనాలు నిర్ణయించిన విధంగా NDEL1, PDE4B, GSK3β, FEZ1 మరియు DISC1 స్వీయ-అసోసియేషన్ సైట్‌లతో పూర్తి-నిడివి DISC1 (L) ప్రోటీన్ యొక్క బైండింగ్ సైట్‌లను చూపించే రేఖాచిత్రం. 14, 9, 4, 10, 21, 15 నల్ల దీర్ఘచతురస్రాలు కాయిల్డ్ కాయిల్-ఏర్పడే సంభావ్యత గల ప్రాంతాలను సూచిస్తాయి, మరియు చుక్కల రేఖ స్కాటిష్ కుటుంబ ట్రాన్స్‌లోకేషన్ యొక్క ట్రాన్స్‌లోకేషన్ బ్రేక్‌పాయింట్‌ను సూచిస్తుంది. పూర్తి-నిడివి DISC1 రూపం క్రింద చూపబడినది నవల వైవిధ్యాలు DISC1 LΔ3, LΔ78T9, Esv1 నుండి అనువదించబడిన ప్రోటీన్ ఐసోఫామ్‌ల ప్రాతినిధ్యం. కుండలీకరణంలో, ఎన్‌సిబిఐ డేటాబేస్ యొక్క ఏప్రిల్ 2011 వెర్షన్ ప్రకారం ట్రాన్స్క్రిప్ట్ యొక్క మూల క్రమం జాబితా చేయబడింది. ప్రోటీన్ పరస్పర చర్యలకు విఘాతం కలిగించే ఎక్సాన్ తొలగింపులతో పాటు, చిన్న ఐసోఫామ్‌లు సి-టెర్మినస్-బైండింగ్ సైట్‌లను కోల్పోవచ్చు.

పూర్తి పరిమాణ చిత్రం

ఇతర ప్రోటీన్లతో కత్తిరించబడిన DISC1 వేరియంట్ల యొక్క సంకర్షణలు సంక్లిష్టంగా కనిపిస్తాయి మరియు కొన్నిసార్లు మా అంచనాలకు భిన్నంగా ఉంటాయి. ఉదాహరణకు, మా డేటా DISC1 స్ప్లైస్ వేరియంట్లు FEZ1 ను బంధిస్తాయని సూచిస్తున్నాయి, అయినప్పటికీ తెలిసిన FEZ1- బైండింగ్ డొమైన్ (అమైనో ఆమ్లాలు 446–633) అన్ని కత్తిరించబడిన DISC1 వేరియంట్లలో లేదు (మూర్తి 3). [9 ] మరోవైపు, PDE4B తో పరస్పర చర్యలు మార్చబడతాయి, అయితే PDE4B DISC1 తో బంధించే N- టెర్మినస్ డొమైన్ కత్తిరించబడిన DISC1 వేరియంట్లలో భద్రపరచబడాలి. పూర్తి-నిడివి గల DISC1 PDE4B కి ఆల్టర్ బైండింగ్‌తో పోల్చితే, FEZ1 లేదా కత్తిరించబడిన ప్రోటీన్‌లలో మార్పుల విషయంలో ఇతర బైండింగ్ సైట్లు సరిపోతాయి. కత్తిరించిన DISC1 వేరియంట్ల చెక్కుచెదరకుండా N- టెర్మినస్‌లో బైండింగ్ డొమైన్ నుండి as హించినట్లుగా, అన్ని చిన్న DISC1 వేరియంట్లు GSK3β ని పూర్తిగా బంధిస్తాయి, అయితే, ఈ పరస్పర చర్యల యొక్క కార్యాచరణ తెలియదు. చిన్న DISC1 ఐసోఫామ్‌లతో GSK3β బంధించడం GSK3β / cat-catenin సిగ్నలింగ్ మార్గం యొక్క క్రియాశీలతలో మార్పులకు దారితీసే అవకాశం ఉంది. మునుపటి నివేదికల నుండి expected హించినట్లుగా, DISC1-NUDEL1 పరస్పర చర్య L మరియు Lv వేరియంట్‌లతో మాత్రమే జరుగుతుంది. 4

SZ ఉన్న రోగులలో NDEL1, GSK3β, FEZ1 మరియు PDE4B యొక్క మార్చబడిన ప్రోటీన్ మరియు / లేదా ట్రాన్స్క్రిప్ట్ స్థాయిల యొక్క ప్రస్తుత ఆధారాలు SZ యొక్క పాథోఫిజియాలజీలో ఈ ప్రోటీన్లు / మార్గాల ప్రమేయాన్ని గట్టిగా సూచిస్తున్నాయి. 11, 12, 13 ఇంతకుముందు, ప్రసవానంతర కాలంతో పోల్చితే పిండం జీవితంలో DISC1 వేరియంట్ల వ్యక్తీకరణ ఎక్కువగా ఉందని మేము నిరూపించాము, 8 వాటి న్యూరో డెవలప్‌మెంటల్ ప్రాముఖ్యతను నొక్కి చెబుతున్నాయి. చిన్న DISC1 ఐసోఫాంలు ప్రోటీన్ కాంప్లెక్స్‌లను రూపొందించగల సామర్థ్యాన్ని కలిగి ఉన్నాయని నిర్ధారించిన తరువాత, అవి మానవ మెదడు అభివృద్ధి సమయంలో క్లిష్టమైన ప్రోటీన్లతో సంకర్షణ చెందుతాయని మేము ulated హించాము. పోస్ట్‌మార్టం మానవ మెదడులోని GSK3β వ్యక్తీకరణ నమూనాను పరిశీలించడం, ఇది కత్తిరించబడిన DISC1 వేరియంట్‌లతో సమానంగా ఉందని చూపిస్తుంది మరియు తద్వారా GSK3β అభివృద్ధి సమయంలో సెల్యులార్ సిగ్నలింగ్‌ను ప్రభావితం చేయడానికి DISC1 తో భాగస్వామ్యాన్ని ఏర్పరుచుకునే సామర్థ్యాన్ని పెంచుతుంది. GSK3β-DISC1 కోసం మౌస్ పిండాలలో కో-ఇమ్యునోప్రెసిపిటేషన్ ప్రయోగాలు అటువంటి పరస్పర చర్యలు తాత్కాలికంగా ఆధారపడి ఉంటాయని ఇప్పటికే ప్రతిపాదించాయి. GSK3β తో సమాంతరంగా వ్యక్తీకరించబడిన SZ లో చిన్న ఐసోఫామ్‌ల యొక్క సుసంపన్నం, అభివృద్ధిలో GSK3β మార్గంలో జోక్యం చేసుకోవచ్చు.

సారాంశంలో, మా ఫలితాలు SZ ఉన్న రోగులలో మరియు DISC1 రిస్క్ యుగ్మ వికల్పాల యొక్క క్యారియర్‌లలో సుసంపన్నమైన DISC1 ప్రోటీన్‌లను పూర్తి-నిడివి DISC1 మరియు ఇతర న్యూరో డెవలప్‌మెంటల్లీ ముఖ్యమైన అణువులతో బంధించడం ద్వారా వారి రోగలక్షణ ప్రభావాలను చూపించే అవకాశాన్ని పెంచుతాయి.

ప్రవేశాల

GenBank / EMBL / DDBJ

  • FJ804188
  • FJ804202
  • FJ804212
  • FJ804213