హిస్టోన్ వేరియంట్ మాక్రోహ్ 2 trpc3 మరియు trpc6 ఛానెల్‌ల ద్వారా ca2 + ప్రవాహాన్ని నియంత్రిస్తుంది | oncogenesis

హిస్టోన్ వేరియంట్ మాక్రోహ్ 2 trpc3 మరియు trpc6 ఛానెల్‌ల ద్వారా ca2 + ప్రవాహాన్ని నియంత్రిస్తుంది | oncogenesis

Anonim

విషయము

  • కాల్షియం చానెల్స్
  • హిస్టోన్ వేరియంట్లు
  • Oncogenesis
  • తాత్కాలిక గ్రాహక సంభావ్య ఛానెల్‌లు

నైరూప్య

హిస్టోన్ వేరియంట్ మాక్రోహెచ్ 2 ఎ క్రోమాటిన్ యొక్క నియమించబడిన ప్రాంతంలో కానానికల్ హెచ్ 2 ఎను భర్తీ చేస్తుంది, ఇక్కడ దాని విలీనం క్రియాత్మకంగా విభిన్నమైన క్రోమాటిన్ డొమైన్‌ను స్థాపించే సామర్థ్యాన్ని కలిగి ఉంటుంది. ట్రాన్సియెంట్ రిసెప్టర్ పొటెన్షియల్ కానానికల్ (టిఆర్పిసి) ఛానెల్స్ అనేది సైటోసోలిక్ Ca 2+ గా ration తలో మార్పులను నియంత్రించే Ca 2+ -పెర్మెబుల్ కాటినిక్ చానెల్స్ యొక్క కుటుంబం. Trpc జన్యు వ్యక్తీకరణ యొక్క సరైన నియంత్రణకు క్రోమాటిన్ పునర్నిర్మాణం అవసరం, కానీ ఈ నియంత్రణ ప్రక్రియల స్వభావం గురించి చాలా తక్కువగా తెలుసు. ఇక్కడ, మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1 రెండు Trpc కుటుంబ జన్యువులైన Trpc3 మరియు Trpc6 ను అణచివేస్తుందని మరియు మూత్రాశయ క్యాన్సర్ కణాలలో Ca 2+ -ఆధారిత విస్తరణ ప్రతిస్పందనలను పెంచుతుందని మేము చూపించాము . మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1 దాని నిరంతర చర్యను సులభతరం చేయడానికి హిస్టోన్ డీసిటైలేస్ 1 (హెచ్‌డిఎసి 1) మరియు హెచ్‌డిఎసి 2 ని నియమిస్తుంది, దీని ఫలితంగా ట్రెప్సి 3 మరియు టిఆర్‌పిసి 6 లోకి అంతటా హిస్టోన్ ఎసిటైలేషన్ యొక్క రాజీ ఏర్పడుతుంది. ఇంకా, మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1 క్షీణత హిస్టోన్ ఎసిటైలేషన్ మరియు సి 2+ ప్రవాహాన్ని పెంచుతుంది, ఇది కణాల పెరుగుదల మరియు దండయాత్రకు దారితీస్తుంది. మా డేటా TRPC3 / TRPC6- మధ్యవర్తిత్వ Ca 2+ సిగ్నలింగ్‌పై కొత్త అంతర్దృష్టులను అందిస్తుంది మరియు Trpc3 మరియు Trpc6 జన్యువుల ట్రాన్స్క్రిప్షనల్ సామర్థ్యాన్ని నియంత్రించడంలో మాక్రోహెచ్ 2A1 కోసం కేంద్ర పాత్రను సూచిస్తుంది.

పరిచయం

క్రోమాటిన్ యొక్క ప్రాథమిక పునరావృత యూనిట్ 147 బేస్ జతల DNA నుండి హిస్టోన్లు H2A, H2B, H3 మరియు H4 యొక్క ఆక్టామెర్ చుట్టూ చుట్టబడిన న్యూక్లియోజోమ్ కోర్ కణం. DNA- అనుబంధ ప్రక్రియలను సరిగ్గా నియంత్రించడానికి, ఈ అణు ప్రోటీన్ కాంప్లెక్స్‌ను హిస్టోన్ సవరణలు, ATP- ఆధారిత క్రోమాటిన్ పునర్నిర్మాణం మరియు హిస్టోన్ వేరియంట్ మార్పిడి వంటి వివిధ పునర్నిర్మాణ విధానాల ద్వారా పునర్వ్యవస్థీకరించాల్సిన అవసరం ఉంది. 1, 2 S దశలో వ్యక్తీకరించబడిన కానానికల్ హిస్టోన్‌లకు భిన్నంగా, హిస్టోన్ వైవిధ్యాలు సెల్ చక్రం అంతటా వ్యక్తీకరించబడతాయి మరియు క్రోమాటిన్‌లో ప్రతిరూపణ-స్వతంత్ర పద్ధతిలో చేర్చబడతాయి. మాక్రోహెచ్ 2 ఎ హెచ్ 2 ఎ వేరియంట్లలో ఒకటి మరియు హెచ్ 2 ఎ-లాంటి డొమైన్‌కు అనుసంధానించబడిన పెద్ద సి-టెర్మినల్ నాన్‌హిస్టోన్ డొమైన్ ఉండటం ద్వారా నిర్వచించబడింది. మాక్రో హెచ్ 2 ఎ ఐసోఫాంలు, మాక్రో హెచ్ 2 ఎ 1 మరియు మాక్రో హెచ్ 2 ఎ 2 ఉన్నాయి, ఇవి ప్రత్యేక జన్యువులచే ఎన్కోడ్ చేయబడ్డాయి. మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1 యొక్క రెండు దగ్గరి-సంబంధిత ఉప రకాలు, మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1.1 మరియు మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1.2, హిస్టోన్ కాని డొమైన్‌లో ప్రత్యామ్నాయ స్ప్లికింగ్ ద్వారా ఉత్పత్తి చేయబడతాయి. 4, 5 X క్రోమోజోమ్ క్రియారహితం యొక్క నిర్వహణలో మాక్రోహెచ్ 2 ఎ పాత్రపై ప్రారంభ పని దృష్టి సారించినప్పటికీ, ఇటీవలి నివేదికలు ఆటోసోమల్ జన్యువులను నిశ్శబ్దం చేయడంలో మాక్రో హెచ్ 2 ఎను బలంగా సూచిస్తాయి. 6, 7, 8 మాక్రోహెచ్ 2 ఎ యొక్క విస్తృత పనితీరుకు మరింత మద్దతు ఇవ్వడానికి, ఇటీవలి జీవరసాయన అధ్యయనాలు మాక్రోహెచ్ 2 ఎ కలిగిన న్యూక్లియోజోమ్‌లు ఎటిపి-ఆధారిత క్రోమాటిన్ పునర్నిర్మాణం మరియు హిస్టోన్ ఎసిటైలేషన్‌కు వక్రీభవనమని మరియు వాటి జ్ఞాన శ్రేణులకు ట్రాన్స్క్రిప్షన్ కారకాలను బంధించడంలో జోక్యం చేసుకుంటాయని తేలింది. 9, 10 క్రోమాటిన్ ట్రాన్స్క్రిప్షన్ యొక్క ప్రతికూల నియంత్రకాలతో మాక్రో హెచ్ 2 ఎ సహకరిస్తుందని కూడా సూచించబడింది. ఈ అనేక ప్రక్రియలలో, హిస్టోన్ డీసిటైలేస్ (హెచ్‌డిఎసి), పాలికాంబ్ రెప్రెసివ్ కాంప్లెక్స్ 2 (పిఆర్‌సి 2) మరియు పాలీ (ఎడిపి రైబోస్) పాలిమరేస్ 1 (PARP1) చేత వివరించబడినట్లుగా, మాక్రోహెచ్ 2 ఎ శారీరక సంకర్షణ మరియు క్రోమాటిన్ రెప్రెసర్ల నియామకం ద్వారా దాని పనితీరును ప్రదర్శిస్తుంది. 6, 11, 12, 13 ప్రస్తుత అధ్యయనానికి ప్రత్యేక సంబంధం ఉన్న, హిస్టోన్ ఎసిటైలేషన్ నేరుగా జన్యు క్రియాశీలతతో ముడిపడి ఉంది మరియు హిస్టోన్ ఎసిటైల్ట్రాన్స్ఫేరేస్ మరియు హెచ్‌డిఎసి యొక్క వ్యతిరేక కార్యకలాపాల ద్వారా డైనమిక్‌గా నిర్వహించబడుతుంది. మా అధ్యయనానికి ఇది చాలా ముఖ్యమైన అంశం, ఎందుకంటే మాక్రోహెచ్ 2 ఎ న్యూక్లియోజోమ్‌ల వద్ద హెచ్‌డిఎసిల స్థిరమైన స్థానికీకరణ క్రోమాటిన్‌లో హిస్టోన్‌ల యొక్క హైపోఅసిటైలేటెడ్ స్థితిని నిర్వహించడానికి సహాయపడుతుంది మరియు చివరికి లిప్యంతరీకరణను నిష్క్రియం చేస్తుంది.

కాల్షియం (Ca 2+ ) సిగ్నలింగ్ విస్తరణ, వలస, జన్యు వ్యక్తీకరణ మరియు సంకోచంతో సహా శారీరక మరియు రోగలక్షణ సెల్యులార్ ప్రతిస్పందనలకు కీలకం. 14, 15 తాత్కాలిక గ్రాహక సంభావ్యత (టిఆర్పి) ఛానెల్స్ కేషన్-కండక్టింగ్ ఛానల్ ప్రోటీన్ల యొక్క పెద్ద మరియు క్రియాత్మకంగా బహుముఖ కుటుంబంగా ఉన్నాయి, ఇవి ప్లాస్మా పొర అంతటా మరియు సైటోప్లాజంలోకి Ca 2+ ప్రవాహాన్ని మధ్యవర్తిత్వం చేస్తాయి. క్షీరద కణాలలో టిఆర్పి ఛానల్స్ యొక్క ఉపకుటుంబమైన టిఆర్పి కానానికల్ (టిఆర్పిసి) ఛానెల్స్ ఏడుగురు సభ్యులను కలిగి ఉన్నాయి మరియు వీటిని క్రమం మరియు క్రియాత్మక హోమోలజీ ప్రకారం మూడు గ్రూపులుగా విభజించవచ్చు: టిఆర్పిసి 1/4/5, టిఆర్పిసి 3/6/7 మరియు టిఆర్పిసి 2. ఈ టిఆర్‌పిసి ఛానెళ్లలో, టిఆర్‌పిసి 3 మరియు టిఆర్‌పిసి 6 70% అమైనో-యాసిడ్ గుర్తింపును పంచుకుంటాయి మరియు ఇవి ప్రధానంగా క్యాన్సర్ అభివృద్ధికి మరియు పురోగతికి దోహదం చేస్తాయి. ఉదాహరణకు, TRPC3 / TRPC6- మధ్యవర్తిత్వ Ca 2+ సిగ్నలింగ్ కాల్మోడ్యులిన్-ఆధారిత ప్రోటీన్ కినేస్ మరియు మైటోజెన్-యాక్టివేటెడ్ ప్రోటీన్ కినేస్‌ను సక్రియం చేస్తుంది, ఇది క్యాన్సర్ కణాల విస్తరణ సామర్థ్యానికి మద్దతు ఇస్తుంది. [15] ఇటీవలి అధ్యయనాలు కూడా TRPC3 మరియు TRPC6 ఛానెల్స్ కార్డియాక్ హైపర్ట్రోఫీని ప్రోత్సహించగలవని మరియు TRPC3 / TRPC6 అతిగా ఎక్స్ప్రెషన్ కొన్ని ప్రాణాంతకత యొక్క పురోగతిని సులభతరం చేస్తుందని వెల్లడించింది. 18, 19, 20, 21 జన్యువుల ట్రాన్స్క్రిప్షన్ స్థితులను స్థాపించడంలో మరియు నిర్వహించడానికి క్రోమాటిన్ పునర్నిర్మాణం యొక్క ముఖ్యమైన పాత్రలను బట్టి, క్రోమాటిన్ సందర్భంలో Trpc3 / Trpc6 ట్రాన్స్క్రిప్షన్ ఎలా నియంత్రించబడుతుందో అర్థం చేసుకోవాలి.

ఇక్కడ, మూత్రాశయ క్యాన్సర్ కణ తంతువులలో TRPC3 / TRPC6- మధ్యవర్తిత్వ Ca 2+ ప్రవాహం యొక్క క్లిష్టమైన నియంత్రకంగా మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1 ను మేము గుర్తించాము. మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1 క్షీణించినప్పుడు Trpc3 మరియు Trpc6 జన్యువుల నుండి ట్రాన్స్క్రిప్షన్ వేగంగా సక్రియం అవుతుంది. మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1 హెచ్‌డిఎసి 1 మరియు హెచ్‌డిఎసి 2 ని నియమిస్తుంది, తద్వారా ట్రెపిసి 3 మరియు టిఆర్‌పిసి 6 జన్యువులలో హిస్టోన్ ఎసిటైలేషన్‌ను రద్దు చేస్తుంది. ఈ ఫలితాలకు మద్దతుగా, మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1 అణచివేత హెచ్‌డిఎసి 1 మరియు హెచ్‌డిఎసి 2 నియామకాలను తగ్గిస్తుంది మరియు ట్రెపిసి 3 / టిఆర్‌పిసి 6 ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్‌ను ప్రోత్సహిస్తుంది, ఇది కణాంతర Ca 2+ స్థాయిలను పెంచుతుంది.

ఫలితాలు

మాక్రో హెచ్ 2 ఎ 1 మూత్రాశయ క్యాన్సర్ కణాల విస్తరణ మరియు దాడిని అణిచివేస్తుంది

మాక్రోహెచ్ 2 ఎ యొక్క సెల్యులార్ ఫంక్షన్లను అధ్యయనం చేసే మొదటి దశగా, పాశ్చాత్య బ్లాటింగ్ ద్వారా మానవ మూత్రాశయం మరియు ప్రోస్టేట్ సెల్ లైన్లలో మాక్రో హెచ్ 2 ఎ 1 యొక్క వ్యక్తీకరణను పరిశీలించాము. మరో మూత్రాశయ కణ రేఖ J82 (Figure 1a) తో పోలిస్తే మూడు మూత్రాశయ కణ తంతువులైన UROtsa, LD611 మరియు RT4 లలో మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1 యొక్క వ్యక్తీకరణ స్థాయిలు ఎక్కువగా ఉన్నాయి. ప్రోస్టేట్ సెల్ లైన్లు LNCaP మరియు MLC కూడా మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1 యొక్క ఎత్తైన స్థాయిలను ప్రదర్శించాయి, అయితే పిసి 3 మరియు డియు 145 (మూర్తి 1 ఎ) అనే రెండు సెల్ లైన్లలో మాక్రో హెచ్ 2 ఎ 1 వ్యక్తీకరణ తక్కువగా ఉంది. 22, 23, 24 జన్యు క్రియారహితం ద్వారా కణితి పురోగతిని అణిచివేసేందుకు మాక్రోహెచ్ 2 ఎ ప్రతిపాదించబడినందున, మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1 వ్యక్తీకరణ రేటు మూత్రాశయ కణాల ఇన్వాసివ్‌నెస్‌తో విలోమ సంబంధం కలిగి ఉందో లేదో మేము తనిఖీ చేసాము. తక్కువ స్థాయి మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1 ను వ్యక్తీకరించే J82 కణాలు UROtsa, LD611 మరియు RT4 కణాలతో పోలిస్తే అధిక మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1 వ్యక్తీకరణ స్థాయిలను చూపిస్తాయి (మూర్తి 1 బి).

Image

మాక్రో హెచ్ 2 ఎ మూత్రాశయ క్యాన్సర్ కణాల విస్తరణ మరియు దండయాత్రను నిరోధిస్తుంది. ( ) మూత్రాశయ కణ తంతువులు (UROtsa, LD611, RT4 మరియు J82) మరియు ప్రోస్టేట్ సెల్ లైన్లు (MLC, LNCaP, PC3 మరియు DU145) RIPA బఫర్‌తో లైస్ చేయబడ్డాయి మరియు వెస్ట్రన్ బ్లాటింగ్‌కు గురయ్యాయి. ( బి ) సూచించిన మూత్రాశయ కణ తంతువులు వేరుచేయబడి, మ్యాట్రిజెల్ తో పూసిన ఎగువ గదిలోకి విత్తనం చేయబడ్డాయి, తరువాత దిగువ గదిలో 10% FBS వైపు దాడి చేయడానికి అనుమతించబడ్డాయి. గ్రాఫ్ నాలుగు ఫీల్డ్‌లకు ఆక్రమించిన కణాల సగటు సంఖ్యను వర్ణిస్తుంది. ND, కనుగొనబడలేదు. ( సి, డి ) నియంత్రణ మరియు మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1-క్షీణించిన ఎల్‌డి 611 ( సి ) మరియు ఆర్‌టి 4 ( డి ) కణాల విస్తరణను MTT కలర్‌మెట్రిక్ అస్సేస్ నిర్ణయించింది. ప్రతి బార్ మూడు స్వతంత్ర ప్రయోగాలలో నాలుగు ప్రతిరకాల సగటు sd ని సూచిస్తుంది. ( , ఎఫ్ ) నియంత్రణ మరియు స్థూల హెచ్ 2 ఎ 1-క్షీణించిన ఎల్డి 611 ( ) మరియు ఆర్టి 4 ( ఎఫ్ ) కణాలను ఉపయోగించి ( బి ) లో చేసిన సెల్ దండయాత్ర పరీక్షలు. ( B, e, f ) లోని ప్రతి బార్ రెండు స్వతంత్ర ప్రయోగాలలో మూడు ప్రతిరకాల సగటు sd ని సూచిస్తుంది. ** పి <0.01; *** పి <0.001.

పూర్తి పరిమాణ చిత్రం

మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1 యొక్క పాత్రను మరింత అంచనా వేయడానికి, మేము ఎల్‌డి 611 మరియు ఆర్టి 4 కణాలలో మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1 ను క్షీణించి, అధిక స్థాయి మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1 ను వ్యక్తీకరించాము మరియు కణాల పెరుగుదల మరియు ఇన్వాసివ్‌నెస్‌లో మార్పులను విశ్లేషించాము. ఈ అధ్యయనంలో, మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1 సుదీర్ఘకాలం క్షీణించడం చాలా ముఖ్యం, ఎందుకంటే ఇది ఒకే పరిస్థితులలో కణాల విస్తరణ యొక్క ప్రగతిశీల మార్పులను అధ్యయనం చేయడానికి అనుమతిస్తుంది. లెంటివైరల్ shRNA సంక్రమణ వ్యవస్థను ఉపయోగించడం ద్వారా ఇది సాధించబడింది. పాశ్చాత్య బ్లాటింగ్ మరియు క్వాంటిటేటివ్ రివర్స్ ట్రాన్స్క్రిప్షన్-పిసిఆర్ (qRT-PCR) మాక్రో హెచ్ 2 ఎ 1 ఎస్ఆర్ఎన్ఎ ప్లాస్మిడ్ల యొక్క స్థిరమైన బదిలీ కణంలోని మాక్రో హెచ్ 2 ఎ 1 యొక్క వ్యక్తీకరణను సమర్థవంతంగా నిశ్శబ్దం చేసిందని ధృవీకరించింది (అనుబంధ మూర్తి ఎస్ 1 బి). మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1 క్షీణత (గణాంకాలు 1 సి మరియు డి) తరువాత ఎల్‌డి 611 మరియు ఆర్‌టి 4 కణాలు చాలా వేగంగా పెరుగుతాయని 8 రోజుల వ్యవధిలో MTT పరీక్షలు పునరుత్పత్తిగా చూపించాయి. ఎండోజెనస్ మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1 యొక్క క్షీణత నియంత్రణ కణాలతో పోలిస్తే కణాల దాడిలో గణనీయమైన పెరుగుదలకు దారితీసింది (గణాంకాలు 1 ఇ మరియు ఎఫ్). ఈ పరిశీలనలు మూత్రాశయ క్యాన్సర్ కణాల విస్తరణ మరియు దండయాత్రను నియంత్రించే ముఖ్య ఆటగాళ్ళలో మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1 ఒకటి అనే othes హకు అనుగుణంగా ఉంటుంది.

మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1 Ca 2+ -ఆధారిత సిగ్నలింగ్ మార్గాలను నిర్దేశించే ట్రాన్స్క్రిప్షనల్ ప్రోగ్రామ్‌లను నియంత్రిస్తుంది

కణాల విస్తరణ మరియు దండయాత్ర సంక్లిష్ట ప్రక్రియలు, ఇవి బహుళ సెల్యులార్ మార్గాల్లో అనేక మార్పులను ప్రతిబింబిస్తాయి. పై ఫలితాల్లో మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1 చేసిన క్రియాత్మక రచనలపై అంతర్దృష్టిని పొందడానికి, మేము నియంత్రణ లేదా మాక్రో హెచ్ 2 ఎ 1-క్షీణించిన ఎల్‌డి 611 కణాల నుండి ఉత్పత్తి చేయబడిన ఆర్‌ఎన్‌ఎను ఉపయోగించి సిడిఎన్ఎ మైక్రోఅరే విశ్లేషణలను చేసాము. క్షీణించిన మరియు నియంత్రణ కణాల పోలిక 41 జన్యువులను నియంత్రించలేదని మరియు 169 జన్యువులను స్థూల హెచ్ 2 ఎ 1 క్షీణత (సప్లిమెంటరీ టేబుల్ ఎస్ 1) పై కనీసం 1.5 రెట్లు నియంత్రించవచ్చని సూచించింది. మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1 టార్గెట్ ట్రాన్స్క్రిప్ట్స్ యొక్క జీన్ ఒంటాలజీ వర్గీకరణ Ca 2+ బైండింగ్ మరియు ఎండోపెప్టిడేస్ కార్యాచరణకు సంబంధించిన జన్యువులలో గణనీయమైన సుసంపన్నతను వెల్లడించింది (మూర్తి 2 ఎ). మైక్రోఅరే డేటాను ధృవీకరించడానికి, మేము 12 జన్యువులపై qRT-PCR ను ప్రదర్శించాము, దీని వ్యక్తీకరణ మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1 క్షీణతపై మెరుగుపరచబడింది మరియు ఇవి Ca 2+ బైండింగ్‌కు సంబంధించినవి. మూర్తి 2 బిలో సంగ్రహంగా, మైక్రోఅరే డేటా మరియు మొత్తం 12 జన్యువులకు qRT-PCR ఫలితాల మధ్య అధిక సంబంధం ఉంది. మైక్రోఅరే డేటా నుండి గమనించదగ్గ పరిశీలన ఏమిటంటే, మాక్రోహెచ్ 2 ఎ క్షీణత Trpc3 మరియు Trpc6 జన్యువుల యొక్క వ్యక్తీకరణను పెంచుతుంది, కానీ ఇతర Trpc కుటుంబ జన్యువులు కాదు (మూర్తి 2 సి), మాక్రోహెచ్ 2A TRPC ఛానెళ్ల జన్యు-నిర్దిష్ట నియంత్రకంగా పనిచేస్తుందని సూచిస్తుంది. క్షీణించిన మరియు నియంత్రణ LD611 మరియు RT4 కణాలలో Ca 2+ ప్రవాహాన్ని పోల్చినప్పుడు, మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1 నాక్‌డౌన్ తర్వాత కణాంతర Ca 2+ సాంద్రతల పెరుగుదల స్పష్టంగా కనబడింది (గణాంకాలు 2 డి మరియు ఇ; అనుబంధ గణాంకాలు ఎస్ 1 సి మరియు డి). ఈ డేటా Ca 2+ ప్రవాహంలో పాల్గొన్న జన్యువుల నియంత్రణలో మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1 ను బలంగా సూచిస్తుంది. ఈ వాదనకు అనుగుణంగా, LD611 కణాలలో రెండు మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1 ఉపరకాలలో ఒకటైన మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1.2 యొక్క ఎక్టోపిక్ వ్యక్తీకరణ 12 సి 2+ బైండింగ్ ప్రోటీన్‌లను (మూర్తి 2 ఐ), ముఖ్యంగా టిఆర్‌పిసి 3 మరియు టిఆర్‌పిసి 6 ఎన్‌కోడింగ్ చేసే జన్యువుల వ్యక్తీకరణను అణచివేసింది. బ్లాటింగ్ (మూర్తి 2 జె). మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1.2 అతిగా ప్రసరణ కణాంతర Ca 2+ ఏకాగ్రతను (మూర్తి 2 కె) తగ్గించిందని చూపించే Ca 2+ ప్రవాహ పరీక్షల ద్వారా ఈ ఫలితాలు మరింత ధృవీకరించబడ్డాయి. ఇంకా, మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1 టిఆర్‌పిసి 3 మరియు టిఆర్‌పిసి 6 ఛానెల్‌ల ద్వారా సి 2+ ప్రవాహాన్ని నియంత్రిస్తుందో లేదో తనిఖీ చేయడంలో, టిఆర్‌పిసి ఛానెళ్లను ఉత్తేజపరిచే ఎటిపి అనే కారకం, 25, 26 మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1-క్షీణించిన కణాలలో మరింత ప్రముఖ కణాంతర Ca 2+ పెరుగుదలను ప్రేరేపించిందని మేము కనుగొన్నాము. నియంత్రణ కణాల కంటే (గణాంకాలు 2f మరియు g). మొత్తంగా, Ca 2+ ప్రవాహ మార్గం యొక్క క్రియాత్మక భాగాల వ్యక్తీకరణను మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1 ప్రతికూలంగా ప్రభావితం చేస్తుందనే ఆలోచనకు ఈ పరిశోధనలు మద్దతు ఇస్తున్నాయి.

Image

మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1 క్షీణత Ca 2+ బైండింగ్ ప్రోటీన్-సంబంధిత జన్యువుల ట్రాన్స్క్రిప్షనల్ సామర్థ్యాన్ని పెంచుతుంది. ( ) మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1-నియంత్రిత జన్యువులను డేవిడ్ బయోఇన్ఫర్మేటిక్స్ వనరులు (//david.abcc.ncifcrf.gov) విశ్లేషించాయి మరియు పరమాణు పనితీరు ఆధారంగా జన్యువుల యొక్క శాస్త్రీయ వర్గీకరణను నియంత్రించబడిన లేదా నియంత్రించని జన్యు సమూహాలుగా ప్రదర్శిస్తారు. ( బి ) మైక్రోఅరే డేటా యొక్క ధ్రువీకరణ కొరకు, Ca 2+ బైండింగ్ ప్రోటీన్లకు సంబంధించిన మరియు మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1-క్షీణించిన కణాలలో నియంత్రించబడిన 12 జన్యువులు qRT-PCR కి లోబడి ఉన్నాయి. Gapdh ను అంతర్గత నియంత్రణ జన్యువుగా ఉపయోగించారు. అన్ని వ్యక్తీకరణ విలువలు β- ఆక్టిన్ సగటుకు సాధారణీకరించబడ్డాయి. ( సి ) నియంత్రణలో Trpc జన్యు వ్యక్తీకరణ మరియు మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1-క్షీణించిన LD611 కణాలు qRT-PCR చే విశ్లేషించబడ్డాయి. ND, కనుగొనబడలేదు. ( డి ) నియంత్రణ మరియు మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1-క్షీణించిన కణాల నుండి కణాల సంగ్రహణలు టిఆర్‌పిసి 3 మరియు టిఆర్‌పిసి 6 లకు వ్యతిరేకంగా ప్రతిరోధకాలతో ఇమ్యునోబ్లోట్ చేయబడ్డాయి. β- ఆక్టిన్ లోడ్ చేయడానికి అంతర్గత నియంత్రణగా ఉపయోగించబడింది. పోల్చదగిన ఫలితాలతో నకిలీలలో విశ్లేషణ జరిగింది. ( ) స్థూల హెచ్ 2 ఎ 1 క్షీణత తరువాత కణాంతర సైటోసోలిక్ Ca 2+ గా ration తలో మార్పులు Ca 2+ -సెన్సిటివ్ డై ఫ్లూ -8NW తో కొలుస్తారు. ( f, g ) ఫ్యూరా -2 AM తో లోడ్ చేయబడిన కంట్రోల్ మరియు మాక్రో హెచ్ 2 ఎ 1-డిలీప్టెడ్ ఎల్డి 611 కణాలు 100 μ M ఎటిపితో ఉత్తేజపరచబడ్డాయి. ATP కి ప్రతిస్పందనగా Ca 2+ యొక్క ప్రతినిధి జాడలు ( f ) లో చూపించబడ్డాయి మరియు కణాంతర Ca 2+ లో మార్పులు ( g ) లో లెక్కించబడ్డాయి. ( h ) LD611 కణాలు నియంత్రణ లేదా మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1.2 వ్యక్తీకరణ వెక్టర్లతో స్థిరంగా బదిలీ చేయబడ్డాయి మరియు mRNA మరియు ప్రోటీన్ స్థాయిలలో మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1.2 యొక్క వ్యక్తీకరణను qRT-PCR (ఎడమ) మరియు వెస్ట్రన్ బ్లాటింగ్ (కుడి) ద్వారా విశ్లేషించారు. ( i ) Ca 2+ బైండింగ్-సంబంధిత జన్యువుల సాపేక్ష వ్యక్తీకరణలను తనిఖీ చేయడానికి qRT-PCR ప్రదర్శించబడింది, ఇవి స్థూల H2A1.2 వ్యక్తీకరణ తర్వాత నియంత్రించబడవు. ( j ) నియంత్రణలో TRPC3 మరియు TRPC6 ప్రోటీన్ స్థాయిలు మరియు మాక్రో హెచ్ 2 ఎ 1.2-ట్రాన్స్‌ఫెక్టెడ్ సెల్ పాశ్చాత్య బ్లాటింగ్ ద్వారా అంచనా వేయబడ్డాయి. ( k ) కణాంతర Ca 2+ గా ration త ( e ) లో ఉన్నట్లు నిర్ణయించబడింది, కానీ స్థూల H2A1.2 వ్యక్తీకరణ తర్వాత. ( B, c, e, g - i, k ) లోని ప్రతి బార్ రెండు స్వతంత్ర ప్రయోగాలలో మూడు ప్రతిరకాల సగటు sd ని సూచిస్తుంది. * పి <0.05; ** పి <0.01; *** పి <0.001.

పూర్తి పరిమాణ చిత్రం

MacroH2A1 మరియు TRPC3 / TRPC6 మూత్రాశయ క్యాన్సర్ నమూనాలలో పరస్పరం వ్యక్తీకరించబడతాయి

మా మైక్రోఅరే ఫలితాలు Ca 2+ బైండింగ్ ప్రోటీన్లకు సంబంధించిన జన్యువులను మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1 ప్రతికూలంగా నియంత్రిస్తుందని సూచించింది. ఈ జన్యువులలో, Trpc3 మరియు Trpc6 ప్రత్యేక కణాలు Ca 2+ ప్రవాహాన్ని నియంత్రించడంలో కీలక పాత్రల కారణంగా ఉన్నాయి. మూత్రాశయ క్యాన్సర్‌లో మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1 వ్యక్తీకరణ టిఆర్‌పిసి 3 / టిఆర్‌పిసి 6 వ్యక్తీకరణతో విలోమ సంబంధం కలిగి ఉందో లేదో పరిశోధించడానికి, 36 మూత్రాశయ క్యాన్సర్ నమూనాలు మరియు 12 సాధారణ కణజాలాలను కలిగి ఉన్న కణజాల మైక్రోరేస్‌లో వాటి వ్యక్తీకరణ నమూనాలను మేము విశ్లేషించాము. మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1, టిఆర్పిసి 3 మరియు టిఆర్పిసి 6 కొరకు ఇమ్యునోహిస్టోకెమికల్ స్టెయినింగ్ యొక్క ప్రతినిధి ఫలితాలు మూర్తి 3 ఎలో చూపించబడ్డాయి. గ్రేడ్ 3 మూత్రాశయ కణితి కణజాలాలలో (∼ 83%) మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1 యొక్క మరక బలహీనంగా లేదా ప్రతికూలంగా ఉంది, అయితే చాలా సాధారణమైన (∼ 66%) మరియు తక్కువ-గ్రేడ్ (గ్రేడ్ 1 మరియు 2) కణితి కణజాలాలలో మరకలు మితంగా లేదా బలంగా ఉన్నాయి. (57%) (మూర్తి 3 బి, ఎడమ; అనుబంధ పట్టిక ఎస్ 2). దీనికి విరుద్ధంగా, 90% మూత్రాశయ కణితి కణజాలాలలో TRPC3 యొక్క మితమైన మరియు బలమైన మరక కనుగొనబడింది, కానీ సిర్కాలో 50% సాధారణ కణజాలాలలో మాత్రమే (మూర్తి 3 బి, మధ్య; అనుబంధ పట్టిక S2). హై-గ్రేడ్ (గ్రేడ్ 3) కణితి కణజాలాలలో (మూర్తి 3 బి, కుడి; సప్లిమెంటరీ టేబుల్ ఎస్ 2) టిఆర్‌పిసి 6 కోసం మోడరేట్ టు స్ట్రాంగ్ స్టెయినింగ్ ఇంటెన్సిటీ స్పష్టంగా ఉంది. ఈ ఫలితాలకు అనుగుణంగా, మూడు మూత్రాశయం (LD611, RT4 మరియు J82) మరియు రెండు ప్రోస్టేట్ క్యాన్సర్ సెల్ లైన్లు (PC3 మరియు DU145) యొక్క మా వెస్ట్రన్ బ్లాట్ విశ్లేషణలు TRPC3 మరియు TRPC6 యొక్క అధిక వ్యక్తీకరణను వాటి సాధారణ ప్రతిరూపాలతో పోలిస్తే చూపించాయి (సప్లిమెంటరీ ఫిగర్ S1E). మొత్తంమీద, ఈ ఫలితాలు జన్యు వ్యక్తీకరణ డేటా (మూర్తి 2) తో మంచి ఒప్పందంలో ఉన్నాయి మరియు తక్కువ మాక్రో హెచ్ 2 ఎ 1 స్థాయిలు మూత్రాశయ కణితి నమూనాల పెద్ద సమూహంలో ఎలివేటెడ్ టిఆర్పిసి 3 / టిఆర్పిసి 6 వ్యక్తీకరణతో సమానంగా ఉన్నాయని సూచిస్తున్నాయి.

Image

టిష్యూ మైక్రోఅరేలో మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1, టిఆర్‌పిసి 3 మరియు టిఆర్‌పిసి 6 యొక్క ఇమ్యునోహిస్టోకెమికల్ స్టెయినింగ్. ( ) 12 సాధారణ కణజాలాలతో మూత్రాశయ కణితి యొక్క 36 కేసులను కలిగి ఉన్న కణజాల మైక్రోరేలు మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1, టిఆర్‌పిసి 3 మరియు టిఆర్‌పిసి 6 కు వ్యతిరేకంగా ప్రతిరోధకాలతో ఇమ్యునోహిస్టోకెమిస్ట్రీకి లోబడి ఉన్నాయి. ప్రతినిధి ఇమ్యునోస్టెయినింగ్ నమూనాల కోసం అధిక-శక్తి మాగ్నిఫికేషన్లు చూపించబడ్డాయి. బార్, 50 μm. ( బి ) మూత్రాశయం సాధారణ మరియు ప్రాణాంతక కణజాలాలలో మాక్రో హెచ్ 2 ఎ 1, టిఆర్పిసి 3 మరియు టిఆర్పిసి 6 యొక్క ఇమ్యునోస్టెయినింగ్ స్కోర్లు. గ్రాఫ్ విభిన్న స్కోర్‌లతో (ప్రతికూల, బలహీనమైన, మితమైన మరియు బలమైన) విభాగాల శాతాన్ని సూచిస్తుంది.

పూర్తి పరిమాణ చిత్రం

HDAC1 / HDAC2 నియామకాలను సులభతరం చేయడం ద్వారా మరియు హిస్టోన్ ఎసిటైలేషన్‌ను నిరోధించడం ద్వారా మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1 Trpc3 / Trpc6 లిప్యంతరీకరణను బలహీనపరుస్తుంది.

మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1 ద్వారా Trpc3 మరియు Trpc6 జన్యువులను అణచివేసినందున, క్రోమాటిన్ ఇమ్యునోప్రెసిపిటేషన్ (ChIP) పరీక్షల ద్వారా Trpc3 మరియు Trpc6 లోకి అంతటా మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1 పంపిణీని మేము పరిశోధించాము. క్రాస్-లింక్డ్ క్రోమాటిన్ నియంత్రణ మరియు మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1-క్షీణించిన కణాల నుండి వేరుచేయబడింది, మరియు రెండు అప్‌స్ట్రీమ్ ప్రాంతాలు (ప్రాంతాలు ఎ మరియు బి), ట్రాన్స్క్రిప్షన్ ప్రారంభ సైట్ (టిఎస్ఎస్; ప్రాంతం సి) మరియు రెండు కోడింగ్ ప్రాంతాలు (ప్రాంతాలు డి మరియు ఇ) (మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1 ఆక్యుపెన్సీ) పరిశీలించబడ్డాయి. మూర్తి 4 ఎ; అనుబంధ మూర్తి ఎస్ 2 ఎ). మేము TSS యొక్క అప్‌స్ట్రీమ్ (ప్రాంతాలు A మరియు B) మరియు దిగువ (ప్రాంతాలు D మరియు E) లను గుర్తించాము, కాని Trpc3 మరియు Trpc6 లోకి (Figure 4b; అనుబంధ మూర్తి S2B) రెండింటిలోనూ TSS (ప్రాంతం C) వద్ద సంకేతాలను తగ్గించాము. ఈ పరిశీలనలు ఇటీవలి జన్యు-వ్యాప్త అధ్యయనాల డేటాతో ఒప్పందంలో ఉన్నాయి, ఇవి TSS ల పరిసరాల్లో స్థూల హెచ్ 2 ఎ యొక్క కనీస ఉనికిని ప్రదర్శించాయి. 6

Image

Trpc6 జన్యువును అణచివేయడంలో HDAC1 మరియు HDAC2 మధ్య మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1-ఆధారిత ఇంటర్‌ప్లే. ( ) ChIP పరీక్షల్లో ఉపయోగించిన Trpc6 లోకస్ వద్ద ఐదు యాంప్లికాన్ల సుమారు స్థానాలు చూపించబడ్డాయి. ( బి - ) ఎల్‌డి 611 కణాలు మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1 నుండి క్షీణించాయి మరియు మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1 ( బి ), హెచ్ 3 ఎసి ( సి ), హెచ్‌డిఎసి 1 ( డి ) మరియు హెచ్‌డిఎసి 2 ( ) లకు వ్యతిరేకంగా ప్రతిరోధకాలను ఉపయోగించి చిప్ ప్రయోగాలు జరిగాయి. సుసంపన్నం కాని ఇన్పుట్ నమూనాలకు సంబంధించి అవపాతం సామర్థ్యాలు Trpc6 లోకస్ అంతటా ఉన్న ఐదు ప్రదేశాలకు qPCR ద్వారా నిర్ణయించబడ్డాయి ( ) లో వర్ణించబడిన మరియు అనుబంధ పట్టిక S3 లో జాబితా చేయబడిన ప్రైమర్‌లతో. ( ఎఫ్ ) qRT-PCR మరియు వెస్ట్రన్ బ్లాట్ విశ్లేషణలు LD611 కణాలలో TRPC6 స్థాయిని నియంత్రణ shRNA మరియు HDAC1 మరియు HDAC2 లను లక్ష్యంగా చేసుకుని shRNA లను ప్రదర్శిస్తాయి. ( g - i ) H3ac ను గుర్తించే యాంటీబాడీని ఉపయోగించి చిప్ పరీక్షలు నియంత్రణ కణాలు మరియు HDAC1 మరియు / లేదా HDAC2 యొక్క క్షీణించిన కణాల నమూనాలపై జరిగాయి. ( j, k ) HDAC1 లేదా HDAC2 యొక్క క్షీణించిన LD611 కణాలు HDAC2 ( j ) మరియు HDAC1 ( k ) కు వ్యతిరేకంగా ప్రతిరోధకాలను ఉపయోగించి Trpc6 జన్యువు యొక్క ChIP పరీక్షలకు లోబడి ఉన్నాయి. ప్రతి బార్ రెండు స్వతంత్ర ప్రయోగాలలో మూడు ప్రతిరకాల సగటు sd ని సూచిస్తుంది. * పి <0.05; ** పి <0.01; *** పి <0.001.

పూర్తి పరిమాణ చిత్రం

మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1-క్షీణించిన కణాలపై చిప్ ప్రయోగాలు చేసినప్పుడు, Trpc3 మరియు Trpc6 లోకి (Figure 4b; అనుబంధ మూర్తి S2B) వద్ద మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1 యొక్క పూర్తి నష్టం కనుగొనబడింది. మాక్రోహెచ్ 2 ఎ హిస్టోన్ ఎసిటైలేషన్‌కు అంతరాయం కలిగిస్తుందని తెలిసినందున, 10, 11 హెచ్ 3 ఎసిటైలేషన్ స్థాయిలు కూడా నిర్ణయించబడ్డాయి. మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1 క్షీణత ఫలితంగా టిఆర్పిసి 6 లోకస్ (మూర్తి 4 సి) వద్ద టిఎస్ఎస్ చుట్టూ హెచ్ 3 ఎసిటైలేషన్ పెరిగింది. అయితే, ఆసక్తికరంగా, మాక్రో హెచ్ 2 ఎ 1 క్షీణతకు (సప్లిమెంటరీ ఫిగర్ ఎస్ 2 సి) ప్రతిస్పందనగా హెచ్ 3 ఎసిటైలేషన్ Trpc3 లోకస్ అంతటా పెరిగింది. ఈ డేటా హిస్టోన్ ఎసిటైలేషన్‌లో గమనించిన మార్పులకు ఏ హెచ్‌డిఎసిలు కారణమవుతాయనే ప్రశ్న తలెత్తింది. HDAC1 మరియు HDAC2 ఉచిత మాక్రోహెచ్ 2 ఎ యొక్క నాన్‌హిస్టోన్ ప్రాంతంతో నేరుగా సంకర్షణ చెందుతాయని తేలింది. అందువల్ల, మాక్రోహెచ్ 2 ఎ హెచ్‌డిఎసి 1 / హెచ్‌డిఎసి 2 నియామకానికి దోహదం చేస్తుంది మరియు క్రోమాటిన్‌లో హిస్టోన్ ఎసిటైలేషన్ స్థితిని మారుస్తుంది. వాస్తవానికి, మాక్రోహెచ్ 2 ఎ యొక్క క్షీణించిన పాత్రలు మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1 క్షీణత తరువాత గణనీయంగా పెరుగుతాయి (ఫిగర్స్ 4 డి మరియు ఇ; సప్లిమెంటరీ ఫిగర్స్ ఎస్ 2 డి మరియు ఇ), టిఆర్పిసి 3 మరియు టిఆర్పిసి 6 లోకి వద్ద హెచ్‌డిఎసి 1 / హెచ్‌డిఎసి 2 ఆక్యుపెన్సీ గణనీయంగా గమనించబడుతోంది. మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1 క్షీణతపై వ్యక్తీకరణ ప్రభావితం కాని Trpc1 మరియు Trpc4 జన్యువులపై చిప్ ప్రయోగాలు అన్ని ప్రతిచర్యలలో చాలా తక్కువ స్థాయి మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1, హెచ్‌డిఎసి 1 మరియు హెచ్‌డిఎసి 2 లను గుర్తించాయి (అనుబంధ గణాంకాలు ఎస్ 3 ఎ-సి).

హెచ్‌డిఎసి 1 మరియు హెచ్‌డిఎసి 2 రెండూ Trpc3 మరియు Trpc6 లొకి వద్ద ఆక్రమించాయి, అవి జన్యువుల యొక్క స్థూల హెచ్ 2 ఎ-ప్రేరిత అణచివేతకు క్రియాత్మకంగా అనుసంధానించబడి ఉన్నాయో లేదో తనిఖీ చేయడానికి మనల్ని ప్రేరేపించాయి. ఈ మేరకు, ఎల్‌డి 611 కణాలు హెచ్‌డిఎసి 1 మరియు హెచ్‌డిఎసి 2 ఎస్‌ఆర్‌ఎన్‌ఏలను వ్యక్తిగతంగా లేదా ఏకకాలంలో ఎన్‌కోడింగ్ చేసే లెంటివైరల్ వెక్టర్స్‌తో బదిలీ చేయబడ్డాయి (అనుబంధ మూర్తి ఎస్ 3 డి), ఆపై టిఆర్‌పిసి 3 మరియు టిఆర్‌పిసి 6 వ్యక్తీకరణపై ప్రభావాలను కొలుస్తారు. మా qRT-PCR మరియు వెస్ట్రన్ బ్లాట్ విశ్లేషణల నుండి, HDAC1 లేదా HDAC2 (Figure 4f; అనుబంధ మూర్తి S2F) యొక్క ఒకే నాక్‌డౌన్ తర్వాత TRPC3 మరియు TRPC6 వ్యక్తీకరణలో గమనించదగ్గ మార్పులు కనుగొనబడలేదు. అయినప్పటికీ, HDAC1 మరియు HDAC2 రెండూ క్షీణించినప్పుడు TRPC3 మరియు TRPC6 వ్యక్తీకరణ యొక్క అధిక స్థాయిలు కనుగొనబడ్డాయి (మూర్తి 4f; అనుబంధ మూర్తి S2F), ఇది Trpc3 మరియు Trpc6 జన్యువులను అణచివేయడంలో రెండు HDAC ల మధ్య పరిహార యంత్రాంగాలను సూచిస్తుంది.

HDAC1 మరియు HDAC2 యొక్క పనితీరుపై మరింత అవగాహన కల్పించడానికి, Trpc3 మరియు Trpc6 లోకి వద్ద మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1 ప్రేరిత హిస్టోన్ డీసిటైలేషన్‌కు HDAC1 మరియు HDAC2 కారణమా అని మేము నిర్ణయించాము. HDAC1 లేదా HDAC2 యొక్క క్షీణించిన కణాలను ఉపయోగించి ChIP ప్రయోగాలు చేసినప్పుడు, H3 ఎసిటైలేషన్ పై కొలవలేని ప్రభావం కనుగొనబడలేదు (గణాంకాలు 4g మరియు h; అనుబంధ గణాంకాలు S2G మరియు H). ఏదేమైనా, HDAC1 మరియు HDAC2 రెండింటి యొక్క క్షీణత Trpc3 మరియు Trpc6 లోకి (Figure 4i; అనుబంధ మూర్తి S2I) వద్ద H3 ఎసిటైలేషన్ స్థాయిలను పెంచింది, ఈ రెండు లోకీల వద్ద హిస్టోన్ ఎసిటైలేషన్‌ను కలవరపెట్టడంలో HDAC1 మరియు HDAC2 యొక్క పరిహార విధులను మళ్ళీ ప్రతిబింబిస్తుంది. ఈ ఆలోచనకు అనుగుణంగా, RNAi చేత Trpc3 మరియు Trpc6 జన్యువుల నుండి హెచ్‌డిఎసి 1 క్షీణత హెచ్‌డిఎసి 2 స్థానికీకరణలో స్పష్టమైన పెరుగుదలతో సమానంగా ఉంది, అయితే హెచ్‌డిఎసి 2 క్షీణత హెచ్‌డిఎసి 1 స్థానికీకరణకు అదే ప్రదేశంలో చేసింది (గణాంకాలు 4 జె మరియు కె; అనుబంధ గణాంకాలు ఎస్ 2 జె, కె, ఎస్ 3 ఇ మరియు ఎఫ్).

HDAC1 మరియు HDAC2 ప్రాధాన్యంగా మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1 న్యూక్లియోజోమ్‌లతో సంకర్షణ చెందుతాయి

మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1 క్షీణత హెచ్‌డిఎసి 1 / హెచ్‌డిఎసి 2 ని టిఆర్‌పిసి 3 మరియు టిఆర్‌పిసి 6 లొకిలకు రిక్రూట్ చేస్తుంది అనే వాస్తవం ఆధారంగా, హెచ్‌డిఎసి 1 / హెచ్‌డిఎసి 2 మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1 న్యూక్లియోజోమ్‌లను బంధించగలదని మేము ప్రతిపాదించాము. ఈ అవకాశాన్ని తనిఖీ చేయడానికి, ఫ్లాగ్-మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1.2 మరియు ఫ్లాగ్-హెచ్ 2 ఎ కొరకు వ్యక్తీకరణ వెక్టర్లతో ఎల్‌డి 611 కణాలు బదిలీ చేయబడ్డాయి. నిర్మాణాల యొక్క సమానమైన వ్యక్తీకరణను ధృవీకరించిన తరువాత, కణ కేంద్రకాల నుండి కరిగే క్రోమాటిన్ శకలాలు తయారు చేయబడ్డాయి మరియు ప్రధానంగా మోనోన్యూక్లియోజోమ్‌లను ఇవ్వడానికి మైక్రోకోకల్ న్యూక్లిస్ (MNase) తో జీర్ణం చేయబడతాయి. ఎక్టోపిక్ మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1.2 లేదా హెచ్ 2 ఎ కలిగిన మోనోన్యూక్లియోజోమ్‌లను యాంటీ-ఫ్లాగ్ యాంటీబాడీతో ఇమ్యునోప్రెసిపిటేట్ చేశారు. కూమాస్సీ బ్లూ స్టెయినింగ్ శుద్ధి చేసిన న్యూక్లియోజోమ్‌లు సమాన మొత్తంలో ఎక్టోపిక్ మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1.2 మరియు హెచ్ 2 ఎ (మూర్తి 5 ఎ) ను కలిగి ఉన్నాయని నిర్ధారించాయి. వివిక్త న్యూక్లియోజోమ్‌ల యొక్క పాశ్చాత్య బ్లాటింగ్ HDAC1 మరియు HDAC2 రెండూ మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1.2 న్యూక్లియోజోమ్‌లను బంధిస్తాయని మరియు వాటి బైండింగ్ H3 ఎసిటైలేషన్ స్థాయిని తగ్గిస్తుందని వెల్లడించింది (మూర్తి 5 బి). HDAC1 మరియు HDAC2 ను H2A న్యూక్లియోజోమ్‌లకు గుర్తించదగిన బైండింగ్ లేనందున, HDAC1 మరియు HDAC2 యొక్క బైండింగ్ నిర్దిష్టంగా ఉంది. అదనంగా, ఎండోజెనస్-ఫ్రీ మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1 మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1 న్యూక్లియోజోమ్‌ల (మూర్తి 5 సి) మాదిరిగానే ఉండే హెచ్‌డిఎసి 1 / హెచ్‌డిఎసి 2-బైండింగ్ లక్షణాలను ప్రదర్శిస్తుంది, హెచ్‌డిఎసి 1 మరియు హెచ్‌డిఎసి 2 మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1 న్యూక్లోజోమ్‌లతో మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1 ద్వారా సంకర్షణ చెందుతాయని సూచిస్తున్నాయి.

Image

HDAC1 మరియు HDAC2 మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1 యొక్క నాన్‌హిస్టోన్ డొమైన్‌తో బంధిస్తాయి. ( ) LD611 కణాలు నియంత్రణ, H2A మరియు మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1.2 ఎక్స్‌ప్రెషన్ వెక్టర్స్‌తో బదిలీ చేయబడ్డాయి మరియు ఇటీవల వివరించిన విధంగా MNase జీర్ణక్రియ ద్వారా మోనోన్యూక్లియోజోమ్‌లు తయారు చేయబడ్డాయి. ఎక్టోపిక్ హిస్టోన్‌లను కలిగి ఉన్న మోనోన్యూక్లియోజోమ్‌లను యాంటీ-ఫ్లాగ్ ఇమ్యునోప్రెసిపిటేషన్ ద్వారా శుద్ధి చేశారు. శుద్ధి చేయబడిన న్యూక్లియోజోమ్‌ల యొక్క హిస్టోన్ కూర్పులను కూమాస్సి తెలివైన నీలి రంగు మరకతో 15% SDS-PAGE విశ్లేషించారు. ( బి ) సూచించిన వ్యక్తీకరణ వెక్టర్లతో బదిలీ చేయబడిన LD611 కణాలు యాంటీ-ఫ్లాగ్ M2 అగరోజ్‌తో క్రిందికి లాగడానికి లోబడి ఉన్నాయి మరియు పాశ్చాత్య బ్లాటింగ్ ద్వారా బౌండ్ ప్రోటీన్లు కనుగొనబడ్డాయి. ( సి ) ఎల్‌డి 611 కణాల నుండి మొత్తం సెల్ సారాలను తయారు చేశారు మరియు యాంటీ-మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1 యాంటీబాడీతో ఇమ్యునోప్రెసిపిటేట్ చేశారు. సూచించిన విధంగా HDAC1, HDAC2 మరియు మాక్రో హెచ్ 2 ఎ 1 లకు వ్యతిరేకంగా ప్రతిరోధకాలతో వెస్ట్రన్ బ్లాటింగ్ ద్వారా అవక్షేపాలను విశ్లేషించారు. ( డి ) మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1.2 జిఎస్‌టి-పూర్తి పొడవు హెచ్‌డిఎసి 1 లేదా జిఎస్‌టి-హెచ్‌డిఎసి 1 తొలగింపు మార్పుచెందగలవారు గ్లూటాతియోన్ సెఫరోస్ 4 బిపై స్థిరీకరించబడలేదు. విస్తృతంగా కడగడం తరువాత, పూసలలో మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1.2 ఉనికిని యాంటీ-మాక్రో హెచ్ 2 ఎ 1 యాంటీబాడీతో వెస్ట్రన్ బ్లాటింగ్ ద్వారా నిర్ణయించారు. ఇన్పుట్ బైండింగ్ ప్రతిచర్యలలో ఉపయోగించే 5% మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1.2 కు అనుగుణంగా ఉంటుంది. సంఖ్యలు అమైనో-ఆమ్ల అవశేషాలను సూచిస్తాయి. ( ) జిఎస్టి పుల్-డౌన్ పరీక్షలు ( డి ) లో వలె జరిగాయి, కాని జిఎస్టి-ఫ్యూజ్డ్ ఫుల్-లెంగ్త్ హెచ్డిఎసి 2 లేదా గ్లూటాతియోన్ సెఫరోస్ పూసలపై స్థిరంగా ఉన్న దాని తొలగింపు మార్పుచెందగలవారు. ( ఎఫ్ ) హెచ్‌డిఎసి 1 మరియు హెచ్‌డిఎసి 2 జిఎస్‌టి-పూర్తి నిడివి గల మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1.2 లేదా జిఎస్‌టి-మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1.2 తొలగింపు మార్పుచెందగలవారితో పొదిగేవి. వెస్ట్రన్ బ్లాటింగ్ ద్వారా HDAC1 మరియు HDAC2 యొక్క బైండింగ్ విశ్లేషించబడింది. 1 మరియు 6 లేన్లు 5% ఇన్పుట్ను సూచిస్తాయి. ( D - f ) లోని ఆస్టరిస్క్‌లు నిర్దిష్ట-కాని బ్యాండ్‌లను సూచిస్తాయి.

పూర్తి పరిమాణ చిత్రం

పైన వివరించిన బైండింగ్ ఫలితాలకు మద్దతు పొందడానికి, మేము బ్యాక్టీరియాతో ఉత్పత్తి చేయబడిన మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1.2, హెచ్‌డిఎసి 1 మరియు హెచ్‌డిఎసి 2 లను ఉపయోగించి విట్రో పుల్-డౌన్ పరీక్షలను నిర్వహించాము. గణాంకాలు 5 డి మరియు ఇలో చూపినట్లుగా, జిఎస్టి-హెచ్డిఎసి 1 మరియు జిఎస్టి-హెచ్డిఎసి 2 రెండూ అతని-మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1.2 తో సంకర్షణ చెందాయి, అయితే జిఎస్టి మాత్రమే చేయలేదు. HDAC1 మరియు HDAC2 యొక్క మూడు విభిన్న ప్రాంతాలతో సారూప్య బైండింగ్ ప్రయోగాలలో, సి-టెర్మినల్ ప్రాంతాలు, కానీ N- టెర్మినల్ ప్రాంతాలు మరియు ఉత్ప్రేరక డొమైన్‌లు కాదు, స్థూల H2A1.2 (గణాంకాలు 5d మరియు e) తో సమర్థవంతంగా సంకర్షణ చెందాయి. అదనంగా, మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1.2 యొక్క హెచ్‌డిఎసి 1 / హెచ్‌డిఎసి 2-ఇంటరాక్టింగ్ ప్రాంతాన్ని మ్యాపింగ్ చేయడంలో, హిస్టోన్ కాని డొమైన్ (అవశేషాలు 123–371) యొక్క బైండింగ్ సులభంగా గుర్తించదగినది, అయితే ఎన్-టెర్మినల్ హెచ్ 2 ఎ-లాంటి డొమైన్ (అవశేషాలు 1–122) HDAC1 / HDAC2 తో స్పష్టమైన పరస్పర చర్య (మూర్తి 5f). అంతేకాకుండా, మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1.2 శకలాలు 123–180 కట్టుబడి ఉన్న హెచ్‌డిఎసి 1 / హెచ్‌డిఎసి 2 పూర్తి-నిడివి గల ప్రోటీన్ వలె సమర్ధవంతంగా, మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1.2 యొక్క ప్రాధమిక హెచ్‌డిఎసి 1 / హెచ్‌డిఎసి 2-బైండింగ్ సామర్థ్యం ఈ ప్రాంతంలో నివసిస్తుందనే నిర్ధారణకు బలం చేకూరుస్తుంది.

మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1 TRPC3 / TRPC6- ఆధారిత పద్ధతిలో గమనించిన సెల్యులార్ మార్పులను నడుపుతుంది

Ca 2+ ప్రవాహాన్ని నియంత్రించే Trpc3 మరియు Trpc6 జన్యువులను లక్ష్యంగా చేసుకోవడం ద్వారా మాక్రోహెచ్ 2 ఎ కణాల పెరుగుదల మరియు దండయాత్రను నిరోధిస్తుందని అనేక పరిశోధనలు సూచిస్తున్నాయి. మొదట, Ca 2+ ప్రవాహ మార్గంలో చిక్కుకున్న జన్యువులలో, Trpc3 మరియు Trpc6 జన్యువులు మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1-క్షీణించిన కణాలలో ఎంపిక చేయబడతాయి. రెండవది, మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1 క్షీణత తరువాత క్రియాశీల లిప్యంతరీకరణ యొక్క ముఖ్య లక్షణం అయిన హెచ్ 3 ఎసిటైలేషన్ కోసం చిప్ సిగ్నల్ Trpc3 మరియు Trpc6 జన్యువులలో మెరుగుపరచబడుతుంది. మూడవది, Trpc3 మరియు Trpc6 జన్యువులకు HDAC1 / HDAC2 నియామకానికి స్థూల H2A1 అవసరం. నాల్గవది, మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1 క్షీణత Ca 2+ ప్రవాహాన్ని ప్రేరేపిస్తుంది మరియు కణాంతర Ca 2+ గా ration తను పెంచుతుంది. మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1 యొక్క గమనించిన ప్రభావాలు టిఆర్‌పిసి 3 మరియు టిఆర్‌పిసి 6 పై ఆధారపడి ఉన్నాయో లేదో తెలుసుకోవడానికి, మేము వాటిని ఎల్‌డి 611 కణాలలో (సప్లిమెంటరీ ఫిగర్స్ ఎస్ 4 ఎ, బి మరియు ఎస్ 5 ఎ) క్షీణించి, కణాల పెరుగుదల మరియు దండయాత్రను కొలిచాము. మూర్తి 6a లో సంగ్రహించినట్లుగా, TRPC6 క్షీణత సెల్ సాధ్యతను గణనీయంగా తగ్గించింది మరియు TRPC3 క్షీణత మధ్యస్తంగా చేసింది. TRPC3 మరియు TRPC6 యొక్క ఏకకాల క్షీణత సెల్ ఎబిబిలిటీలో మరింత ప్రముఖ తగ్గింపును ఉత్పత్తి చేసింది (అనుబంధ మూర్తి S5B). మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1 యొక్క సారూప్య క్షీణతపై టిఆర్‌పిసి 3 / టిఆర్‌పిసి 6 నిశ్శబ్దం యొక్క గమనించిన ప్రభావాలు ఎక్కువగా మాయమయ్యాయి, ఇది మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1 మరియు టిఆర్‌పిసి 3 / టిఆర్‌పిసి 6 మధ్య క్రియాత్మక సంబంధాన్ని నిర్ధారిస్తుంది. సెల్ ఎబిలిబిలిటీ అస్సేస్ ఫలితాలకు అనుగుణంగా, టిఆర్పిసి 3 మరియు టిఆర్పిసి 6 (మూర్తి 6 బి; సప్లిమెంటరీ ఫిగర్ ఎస్ 5 సి) యొక్క వ్యక్తిగత లేదా ఏకకాల నాక్డౌన్ తరువాత LD611 సెల్ దండయాత్ర కూడా తీవ్రంగా తగ్గింది. మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1 యొక్క ఏకకాల అణచివేత LD611 సెల్ దండయాత్రపై TRPC3 / TRPC6 క్షీణత యొక్క ప్రభావాలను తగ్గించింది. ఈ పరిశీలనల ఆధారంగా, మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1 ఇతర జన్యువుల కంటే Trpc3 మరియు Trpc6 యొక్క వ్యక్తీకరణను ఎంపిక చేసుకోవడం ద్వారా కణాల పెరుగుదల మరియు దండయాత్రను నిరోధిస్తుంది.

Image

TRPC3 / TRPC6 నిశ్శబ్దం చేయడం వల్ల స్థూల హెచ్ 2 ఎ 1 ఫంక్షన్ కోల్పోతుంది. ( ) సూచించిన విధంగా TRPC3, TRPC6 మరియు / లేదా మాక్రో హెచ్ 2 ఎ 1 యొక్క క్షీణించిన కణాలను ఉపయోగించి కణాల విస్తరణ పరీక్షలు నాలుగు రెట్లు జరిగాయి. ప్రతి బార్ మూడు స్వతంత్ర ప్రయోగాలలో నాలుగు ప్రతిరకాల సగటు sd ని సూచిస్తుంది. ( బి ) TRPC3, TRPC6 మరియు / లేదా స్థూల H2A1 యొక్క క్షీణించిన కణాలను ఉపయోగించి సెల్ దండయాత్ర పరీక్షలు జరిగాయి. ప్రతి బార్ రెండు స్వతంత్ర ప్రయోగాలలో మూడు ప్రతిరకాల సగటు sd ని సూచిస్తుంది. * పి <0.05; ** పి <0.01; *** పి <0.001. ( సి ) మాక్రోహెచ్ 2 ఎ మరియు హెచ్‌డిఎసి 1 / హెచ్‌డిఎసి 2 చే Trpc3 / Trpc6 జన్యు నియంత్రణ నమూనా. అణచివేత సెల్యులార్ సిగ్నల్‌లకు ప్రతిస్పందనగా, మాక్రోహెచ్ 2 ఎను Trpc3 మరియు Trpc6 లోకిలో చేర్చారు. మాక్రోహెచ్ 2 ఎ యొక్క హిస్టోన్ కాని డొమైన్ భౌతికంగా HDAC1 మరియు HDAC2 లతో సంకర్షణ చెందుతుంది, మరియు ఈ పరస్పర చర్య HDAC1 మరియు HDAC2 లను Trpc3 మరియు Trpc6 లొకిలకు నియమించటానికి ప్రతిపాదించబడింది. ఇది హిస్టోన్ డీసిటైలేషన్ మరియు Trpc3 / Trpc6 జన్యు నిశ్శబ్ధానికి దారితీస్తుంది. మరిన్ని వివరాల కోసం చర్చ చూడండి.

పూర్తి పరిమాణ చిత్రం

చర్చా

మాక్రోహెచ్ 2 ఎ-ప్రేరిత జన్యు నిశ్శబ్దం క్యాన్సర్ దీక్ష మరియు పురోగతి నియంత్రణలో చిక్కుకున్నప్పటికీ, ఈ ప్రక్రియలకు మాక్రోహెచ్ 2 ఎను అనుసంధానించే ఖచ్చితమైన యంత్రాంగాలు ఉద్భవించటం ప్రారంభించాయి. ప్రస్తుత అధ్యయనంలో, మేము మానవ మూత్రాశయ క్యాన్సర్ కణాలను ఉపయోగించాము మరియు మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1 ను Trpc3 మరియు Trpc6 జన్యువుల యొక్క కీ ట్రాన్స్క్రిప్షనల్ రెప్రెసర్‌గా గుర్తించాము, దీని వ్యక్తీకరణ ప్లాస్మా పొరలో Ca 2+ -పెర్మెబుల్ మార్గాన్ని స్థాపించడానికి కీలకమైనది. మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1, టిఆర్పిసి 3 మరియు టిఆర్పిసి 6 జన్యువులపై హిస్టోన్ ఎసిటైలేషన్ వ్యాప్తికి ఆటంకం కలిగించడమే కాక, జన్యువుల వద్ద హెచ్డిఎసి 1 / హెచ్డిఎసి 2 నియామకాన్ని కూడా సులభతరం చేస్తుంది (మూర్తి 6 సి చూడండి). మా జ్ఞానానికి, అయాన్ ఛానల్ జన్యువుల వ్యక్తీకరణను నియంత్రించే క్రోమాటిన్ పునర్నిర్మాణ ప్రక్రియలకు ఉదాహరణను అందించడానికి మరియు మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1 మరియు హెచ్‌డిఎసి 1 / హెచ్‌డిఎసి 2 మధ్య క్రియాత్మక సహకారాన్ని చూపించడానికి ఇది మొదటి అధ్యయనం.

నిర్దిష్ట ట్రాన్స్క్రిప్షనల్ మాడ్యులేటర్‌గా మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1 పాత్రను పరిశోధించడానికి, మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1-క్షీణించిన మూత్రాశయ క్యాన్సర్ కణాల జన్యు వ్యక్తీకరణ ప్రొఫైల్‌లను మాక్-క్షీణించిన కణాలతో పోల్చాము. స్థూల హెచ్ 2 ఎ క్షీణత తరువాత మూత్రాశయ క్యాన్సర్ కణాల జన్యు వ్యక్తీకరణ ప్రొఫైల్‌లో చాలా మార్పులు జరిగాయి, మరియు మార్చబడిన జన్యువుల పరమాణు విధులు ముఖ్యంగా Ca 2+ -ఆధారిత కణాల విస్తరణ ప్రతిస్పందనలకు దోహదపడే ఫంక్షన్ల కోసం సమృద్ధిగా ఉన్నాయి. గణనీయంగా మార్చబడిన జన్యువులలో, మేము మరింత అధ్యయనం కోసం Trpc3 మరియు Trpc6 ని ఎంచుకున్నాము ఎందుకంటే వాటి జన్యు ఉత్పత్తులు Ca 2+ ప్రవేశ మార్గంతో నేరుగా సంబంధం కలిగి ఉంటాయి. ChIP పరీక్షల ద్వారా Trpc3 మరియు Trpc6 జన్యువులలోని ఐదు ప్రాంతాలను పరిశీలించడంలో, జన్యువుల అప్‌స్ట్రీమ్ మరియు దిగువ రెండింటిలోనూ మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1 ఆక్యుపెన్సీని మేము గుర్తించాము. మాక్రోహెచ్ 2 ఎ జన్యువుపై విస్తృతంగా పంపిణీ చేయబడిందని మరియు క్రోమాటిన్ యొక్క ట్రాన్స్క్రిప్షనల్ సామర్థ్యాన్ని పెద్ద ఎత్తున నియంత్రిస్తుందని సూచించే మునుపటి అధ్యయనాలకు అనుగుణంగా ఈ ఫలితాలు ఉన్నాయి. 6, 7, 27

మాక్రోహెచ్ 2 ఎ కోసం అణచివేత పాత్రకు మరింత మద్దతుగా, మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1-క్షీణించిన పరిస్థితులలో హెచ్ 3 ఎసిటైలేషన్ యొక్క యాదృచ్చిక రూపాన్ని Trpc3 లోకస్ అంతటా కనుగొనబడింది. అయినప్పటికీ, మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1-క్షీణించిన కణాలలో గమనించిన టిఆర్‌పిసి 6 ట్రాన్స్‌యాక్టివేషన్ టిఎస్‌ఎస్‌ల సమీపంలో హెచ్ 3 ఎసిటైలేషన్‌తో ఉంటుంది. మాక్రో హెచ్ 2 ఎ 1 యొక్క అణచివేత ప్రభావాలను నివారించడానికి జన్యువు యొక్క 5 ′ చివరల చుట్టూ ఉన్న ఎసిటైలేషన్ సిగ్నల్స్ సరిపోతాయని మేము ulate హిస్తాము, ఇది జన్యువు అంతటా పంపిణీ చేయబడుతుంది. మా ఫలితాల ఆధారంగా మరియు మునుపటి అధ్యయనాల ఫలితాల ఆధారంగా, మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1 యొక్క హిస్టోన్ కాని డొమైన్ ద్వారా హిస్టోన్ ఎసిటైల్ట్రాన్స్ఫేరేస్ కార్యకలాపాలకు వ్యతిరేకంగా హిస్టోన్ తోకలను రక్షించడం ద్వారా మేము గమనించిన 10, 11 మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1-మధ్యవర్తిత్వ జన్యు నిశ్శబ్దం కనిపిస్తుంది. మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1-క్షీణించిన కణాలను ఉపయోగించి చిప్ విశ్లేషణలో సానుకూల సంకేతం హిస్టోన్ ఎసిటైలేషన్ ఉనికిని గట్టిగా సూచిస్తున్నప్పటికీ, నియంత్రణ కణాలలో ఎసిటైలేషన్ సిగ్నల్ లేకపోవడం మాక్రో హెచ్ 2 ఎ 1 న్యూక్లియోజోమ్‌లలో హిస్టోన్ తోకలకు తక్కువ ప్రాప్యతను ప్రతిబింబిస్తుందని వాదించవచ్చు. మార్పు. అయినప్పటికీ, మా చిప్ ప్రయోగాలలో మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1 క్షీణత హెచ్ 3 కె 4, హెచ్ 3 కె 9 మరియు హెచ్ 3 కె 27 వద్ద హిస్టోన్ మిథైలేషన్లను మారుస్తుంది అనే వాస్తవం ఈ అవకాశానికి వ్యతిరేకంగా శక్తివంతమైన వాదనను కలిగి ఉంది (అనుబంధ గణాంకాలు ఎస్ 6 ఎ-సి).

ఈ అధ్యయనం యొక్క మరొక ముఖ్యమైన అన్వేషణ ఏమిటంటే, మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1 హెచ్‌డిఎసి 1 మరియు హెచ్‌డిఎసి 2 లతో సహకరించి, ట్రెపిసి 3 మరియు టిఆర్‌పిసి 6 జన్యువులను నిష్క్రియాత్మక స్థితిలో నిర్వహించడానికి. ఈ అన్వేషణ మాక్రోహెచ్ 2 ఎ మరియు హెచ్‌డిఎసి 1 / హెచ్‌డిఎసి 2 మధ్య ప్రత్యక్ష పరస్పర చర్యను చూపించే మునుపటి ఇన్ విట్రో డేటాకు అనుగుణంగా ఉంటుంది. [11] అదనంగా, మా ఫంక్షనల్ అధ్యయనాలు HDAC1 మరియు HDAC2 యొక్క స్పష్టమైన పునరుక్తిని చూపించాయి మరియు అవి Trpc3 మరియు Trpc6 జన్యువుల యొక్క స్థూల H2A1- మధ్యవర్తిత్వ అణచివేతలో పరిహార విధులను కలిగి ఉన్నాయని నిర్ధారించాయి . మాక్రోహెచ్ 2 ఎ ఎక్స్ఛేంజ్ మరియు అణచివేత హిస్టోన్ మార్పుల మధ్య గట్టి సంబంధం ఉన్నందున ఈ అన్వేషణ స్థిరంగా ఉంటుంది. హిస్టోన్ ఎసిటైలేషన్ రేటులో మార్పుల ద్వారా హెచ్‌డిఎసిలు క్రోమాటిన్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్‌ను ప్రభావితం చేస్తాయని సాధారణంగా గుర్తించబడినప్పటికీ, జన్యు లిప్యంతరీకరణపై హెచ్‌డిఎసిల యొక్క పరోక్ష ప్రభావాన్ని మేము ఖచ్చితంగా తోసిపుచ్చలేము. ఏది ఏమయినప్పటికీ, హెచ్‌డిఎసి 1 మరియు హెచ్‌డిఎసి 2 ఎన్నుకోబడని మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1 న్యూక్లియోజోమ్‌లతో అనుబంధంగా ఉన్నాయని కనుగొన్నది, హెచ్‌డిఎసి 1 మరియు హెచ్‌డిఎసి 2 ద్వారా ఉత్పత్తి చేయబడిన క్రోమాటిన్ అణచివేత వారి లక్ష్య సైట్లలోని హిస్టోన్ డీసిటైలేషన్ మీద ఆధారపడి ఉంటుందని గట్టిగా సూచిస్తుంది.

ఇటీవల, కపూర్ మరియు ఇతరులు. [22] మధ్యవర్తి సబ్ కాంప్లెక్స్ యొక్క సబ్యూనిట్ అయిన సిడికె 8 యొక్క ట్రాన్స్క్రిప్షనల్ అణచివేత, మెలనోమా కణాల విస్తరణ యొక్క స్థూల హెచ్ 2 ఎ-ఆధారిత అణచివేత యొక్క కీలకమైన భాగం. అందువల్ల, మూత్రాశయ క్యాన్సర్ కణాలలో మాడ్రోహెచ్ 2 ఎ 1 కు సిడికె 8 సంభావ్య లక్ష్యంగా ఉంటుందని మరియు మాక్రో హెచ్ 2 ఎ 1-మధ్యవర్తిత్వ వృద్ధి అణచివేతలో పాల్గొంటుందని expected హించవచ్చు. అయినప్పటికీ, ఈ అవకాశాన్ని పరిశీలించడంలో, CDK8 వ్యక్తీకరణపై స్థూల హెచ్ 2 ఎ 1 క్షీణత యొక్క ప్రభావాలను మేము గమనించలేదు. CDK8 అధ్యయనంలో ఉపయోగించిన మెలనోమా కణాలు మరియు ఈ అధ్యయనంలో ఉపయోగించిన LD611 మూత్రాశయ కణాలలో మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1 వ్యక్తీకరణ మరియు జన్యువు అంతటా దాని స్థానం భిన్నంగా ఉండవచ్చు. అలాగే, వివిధ క్యాన్సర్ కణాలలో HDAC1 / HDAC2 యొక్క వైవిధ్యమైన వ్యక్తీకరణ మరియు స్థానికీకరణ ఉంది, ఇవి మాక్రోహెచ్ 2 ఎ యొక్క లక్ష్యాలపై పని చేయగల సామర్థ్యంపై నాటకీయ ప్రభావాలను కలిగిస్తాయి. మాక్రోహెచ్ 2 ఎ యొక్క సెల్యులార్ స్థాయిలో మార్పులు lung పిరితిత్తుల క్యాన్సర్‌లో కూడా కనుగొనబడ్డాయి మరియు PARP1 ప్రోటీన్ స్థాయిలను తగ్గించడం ద్వారా కణాల విస్తరణలో చిక్కుకున్నాయి. క్యాన్సర్ కణాల పెరుగుదలను స్థూల అణచివేత కణ రకాలను బట్టి బహుళ యంత్రాంగాలను మరియు లక్ష్యాలను ఉపయోగిస్తుందని ఈ డేటా సూచిస్తుంది, భవిష్యత్ అధ్యయనాలలో వీటిని మరింత వివరంగా పరిష్కరించాల్సిన అవసరం ఉంది.

మునుపటి అధ్యయనాలు TRPC3 మరియు TRPC6 ఛానెల్స్ ప్రోస్టేట్, రొమ్ము, కాలేయం మరియు మెదడు వంటి వివిధ రకాల క్యాన్సర్ కణాల పెరుగుదలకు మరియు విస్తరణకు దోహదం చేస్తాయని చూపించాయి. 18, 19, 20, 21, 29, 30 ప్రస్తుత అధ్యయనం మూత్రాశయ క్యాన్సర్ కణాలపై ఈ మునుపటి ఫలితాలను మరింత ముందుకు తెస్తుంది, మరియు TRPC3 మరియు TRPC6 Ca 2+ -మీడియేటెడ్ సెల్ విస్తరణ యొక్క ముఖ్య నియంత్రకాలు అని సూచిస్తుంది. వాస్తవానికి, ఈ అధ్యయనంలో వివరించిన ఫలితాలు Trpc3 మరియు Trpc6 జన్యువులలో మాక్రోహెచ్ 2 ఎ 1 మార్పిడి మరియు హెచ్‌డిఎసి 1 / హెచ్‌డిఎసి 2- మెడియేటెడ్ హిస్టోన్ డీసిటైలేషన్ Ca 2+ ప్రవాహం యొక్క నియంత్రణకు దోహదం చేస్తాయని మొదటి ప్రదర్శనను అందిస్తుంది. ఏదేమైనా, చాలా ఆసక్తికరమైన ప్రశ్నలకు సమాధానం ఇవ్వవలసి ఉంది. ఉదాహరణకు, మాక్రోహెచ్ 2 ఎ మరియు హెచ్‌డిఎసి 1 / హెచ్‌డిఎసి 2 ల మధ్య గుర్తించబడిన ఇంటర్‌ప్లేతో పాటు, ఇతర క్రోమాటిన్ పునర్నిర్మాణ కార్యకలాపాలు, టిఆర్‌పిసి 3 మరియు టిఆర్‌పిసి 6 జన్యువులు లేదా ఇతర టిఆర్‌పిసి సభ్యుల రాజ్యాంగబద్ధంగా అణచివేయబడిన రాష్ట్రాల ఏర్పాటులో పాల్గొంటున్నాయో తెలియదు . హిస్టోన్ ఎసిటైల్ట్రాన్స్ఫేరేస్ క్రోమాటిన్ ట్రాన్స్క్రిప్షన్ను సక్రియం చేస్తుంది, మాక్రోహెచ్ 2 ఎ మరియు హెచ్డిఎసి 1 / హెచ్డిఎసి 2 పాత్రలకు విరుద్ధంగా, Ca 2+ ప్రవాహంలో Trpc జన్యువుల నియంత్రణను పరిశీలించే భవిష్యత్ పని కూడా మాక్రోహెచ్ 2 ఎ మరియు హెచ్డిఎసి 1 / హెచ్డిఎసి 2 లకు వ్యతిరేకంగా హిస్టోన్ ఎసిటైల్ట్రాన్స్ఫేరేసెస్ యొక్క పోటీ చర్యపై దృష్టి పెట్టాలి.

అనుబంధ సమాచారం

PDF ఫైళ్లు

  1. 1.

    అనుబంధ గణాంకాలు

  2. 2.

    అనుబంధ పట్టిక S1

  3. 3.

    అనుబంధ పట్టిక S2

  4. 4.

    అనుబంధ పట్టిక S3

పద పత్రాలు

  1. 1.

    అనుబంధ మూర్తి లెజెండ్స్

    ఆంకోజెనెసిస్ వెబ్‌సైట్ (//www.nature.com/oncsis) లోని ఈ కాగితంతో అనుబంధ సమాచారం వస్తుంది.