సంరక్షించబడిన నెమటోడ్ సిగ్నలింగ్ అణువులు మొక్కల రక్షణ మరియు వ్యాధికారక నిరోధకతను తెలియజేస్తాయి | ప్రకృతి సమాచార మార్పిడి

సంరక్షించబడిన నెమటోడ్ సిగ్నలింగ్ అణువులు మొక్కల రక్షణ మరియు వ్యాధికారక నిరోధకతను తెలియజేస్తాయి | ప్రకృతి సమాచార మార్పిడి

Anonim

విషయము

  • పరాన్నజీవనం
  • మొక్కల రోగనిరోధక శక్తి
  • ప్లాంట్ సిగ్నలింగ్

నైరూప్య

సంరక్షించబడిన సూక్ష్మజీవి-అనుబంధ పరమాణు నమూనాల (MAMP లు) అవగాహన ద్వారా మొక్కల-రక్షణ ప్రతిస్పందనలు ప్రేరేపించబడతాయి, ఉదాహరణకు, ఫ్లాగెల్లిన్ లేదా పెప్టిడోగ్లైకాన్. ఏది ఏమయినప్పటికీ, మొక్కల-పరాన్నజీవి జంతువుల నుండి తీసుకోబడిన సంరక్షించబడిన పరమాణు నమూనాలను మొక్కలు గుర్తించగలదా అనేది తెలియదు. మొక్క-పరాన్నజీవి నెమటోడ్ల యొక్క అనేక జాతులు ఆస్కరోసైడ్లు అని పిలువబడే చిన్న అణువులను ఉత్పత్తి చేస్తాయని ఇక్కడ చూపించాము, ఇది నెమటోడ్ ఫేర్మోన్ల యొక్క పరిణామాత్మకంగా సంరక్షించబడిన కుటుంబం. మొక్క-పరాన్నజీవి నెమటోడ్లలోని ప్రధాన అస్కరోసైడ్ అయిన పిస్కోమోలార్ నుండి మైక్రోమోలార్ సాంద్రతలు, MAMP- ప్రేరేపిత రోగనిరోధక శక్తితో సంబంధం ఉన్న జన్యువుల వ్యక్తీకరణ, మైటోజెన్-ఉత్తేజిత ప్రోటీన్ కైనేసుల క్రియాశీలత, అలాగే సాల్సిలిక్ ఆమ్లం- మరియు జాస్మోనిక్ యాసిడ్-మెడియేటెడ్ డిఫెన్స్ సిగ్నలింగ్ మార్గాలు. Ascr # 18 అవగాహన అరబిడోప్సిస్ , టమోటా, బంగాళాదుంప మరియు బార్లీలలో వైరల్, బాక్టీరియల్, ఓమైసెట్, ఫంగల్ మరియు నెమటోడ్ ఇన్ఫెక్షన్లకు నిరోధకతను పెంచుతుంది. ఈ ఫలితాలు మొక్కలు ఆస్కరోసైడ్లను నెమటోడ్ల యొక్క సంరక్షించబడిన పరమాణు సంతకంగా గుర్తించాయని సూచిస్తున్నాయి. మొక్కల రోగనిరోధక ప్రతిస్పందనలను సక్రియం చేయడానికి ఆస్కరోసైడ్లు వంటి చిన్న-అణువుల సంకేతాలను ఉపయోగించడం వ్యవసాయం యొక్క ఆర్థిక మరియు పర్యావరణ స్థిరత్వాన్ని మెరుగుపరచడానికి సంభావ్య ప్రయోజనాన్ని కలిగి ఉంటుంది.

పరిచయం

నిర్దిష్ట పరమాణు నమూనాల గుర్తింపు మొక్కలు మరియు జంతువుల రోగనిరోధక ప్రతిస్పందనలలో ప్రధాన పాత్ర పోషిస్తుందని తేలింది 1, 2 . మొక్కలు మరియు జంతువులు రెండూ నమూనా గుర్తింపు గ్రాహకాలను కలిగి ఉంటాయి, ఇవి నిర్దిష్ట తరగతుల సూక్ష్మజీవులతో సంబంధం ఉన్న వివిధ పరమాణు సంతకాలను గుర్తించడానికి ఉపయోగపడతాయి. ఉదాహరణకు, ఫ్లాబిల్లిన్, లిపోపాలిసాకరైడ్, పెప్టిడోగ్లైకాన్ మరియు ఇతర MAMP లకు నిర్దిష్ట నమూనా గుర్తింపు గ్రాహకాలను ఉపయోగించి అరబిడోప్సిస్ బ్యాక్టీరియాను గుర్తిస్తుంది. MAMP లు తరచుగా తక్కువ సాంద్రతలతో గ్రహించబడతాయి మరియు నిర్దిష్ట రక్షణ ప్రతిస్పందనలను ప్రేరేపిస్తాయి. MAMP ల యొక్క అవగాహన, సంరక్షించబడిన సిగ్నల్-ట్రాన్స్డక్షన్ మెకానిజమ్‌లను కలిగి ఉన్నట్లు చూపబడింది, వీటిలో మైటోజెన్-యాక్టివేటెడ్ ప్రోటీన్ కినాసెస్ (MAPK లు), రియాక్టివ్ ఆక్సిజన్ జాతుల ఉత్పత్తి మరియు సాల్సిలిక్ యాసిడ్ (SA) - మరియు జాస్మోనిక్ ఆమ్లం (JA) - సిగ్నలింగ్ మార్గాలు 4, 5, 6 .

నెమటోడ్లు భూమిపై చాలా ఎక్కువ జంతువులు. ఇవి మట్టిలో సర్వవ్యాప్తి చెందుతాయి మరియు చాలా మొక్కలను మరియు జంతువులను పరాన్నజీవి చేస్తాయి. మొక్క-పరాన్నజీవి నెమటోడ్లు ప్రపంచవ్యాప్తంగా సంవత్సరానికి billion 100 బిలియన్ల కంటే ఎక్కువ వ్యవసాయ నష్టాన్ని కలిగిస్తాయి. 9, 10, 11 మొక్కలలోని ఇతర వ్యాధికారక కారకాలచే ప్రేరేపించబడిన రక్షణ మార్గాలను వేగంగా సక్రియం చేయడం ద్వారా మొక్కలు-పరాన్నజీవి నెమటోడ్ టీకాలకు మొక్కలు ప్రతిస్పందిస్తాయని అనేక అధ్యయనాలు చూపించాయి. అయినప్పటికీ, మొక్కలచే గ్రహించబడిన నెమటోడ్-ఉత్పన్న సంకేతాల స్వభావం తెలియదు. ఆసక్తికరంగా, మొక్కలను పరాన్నజీవి చేయని ఎంటోమోపాథోజెనిక్ నెమటోడ్లు, మొక్కల రక్షణను కూడా ప్రేరేపిస్తాయి, వీటిలో పాథోజెనెసిస్-రిలేటెడ్ ప్రోటీన్ -1 ( పిఆర్ -1 ) యొక్క వ్యక్తీకరణ మరియు పెరిగిన ఉత్ప్రేరక మరియు పెరాక్సిడేస్ కార్యాచరణ 12 ఉన్నాయి . సంరక్షించబడిన నెమటోడ్ సంతకం అణువు యొక్క గుర్తింపు మొక్క యొక్క రక్షణ ప్రతిస్పందనకు కారణమవుతుందని ఇది సూచిస్తుంది.

13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 అభివృద్ధి మరియు సామాజిక ప్రవర్తనలను నియంత్రించడానికి నెమటోడ్లు పరిణామాత్మకంగా సంరక్షించబడిన సిగ్నలింగ్ అణువుల కుటుంబం, ఆస్కరోసైడ్లపై ఆధారపడుతున్నాయని ఇటీవలి రచనలు చూపించాయి. అస్కరోసైడ్లు కొవ్వు ఆమ్లం-ఉత్పన్నమైన లిపోఫిలిక్ సైడ్ గొలుసును కలిగి ఉన్న డైడియోక్సిసుగర్ అస్కారిలోజ్ యొక్క గ్లైకోసైడ్లు మరియు ఇవి నెమటోడ్ల నుండి ప్రత్యేకంగా గుర్తించబడ్డాయి. ఉదాహరణకు, మోడల్ జీవులలో, కైనోర్హాబ్డిటిస్ ఎలిగాన్స్ 22 మరియు ప్రిస్టిన్చస్ పాసిఫికస్ , 23, అలాగే క్రిమి-పరాన్నజీవి నెమటోడ్ హెటెరోరాబ్డిటిస్ బాక్టీరియోఫోరాలో , ఆస్కరోసైడ్ల యొక్క 20 జాతుల-నిర్దిష్ట మిశ్రమాలు ఒత్తిడి-నిరోధక వ్యాప్తి లేదా ఇన్ఫెక్టివ్ లార్వా దశల్లోకి ప్రవేశించడాన్ని నియంత్రిస్తాయి. వేర్వేరు నిర్మాణాత్మక వైవిధ్యాలు భిన్నమైన కార్యాచరణ ప్రొఫైల్‌లతో సంబంధం కలిగి ఉంటాయి మరియు జీవసంబంధ కార్యకలాపాలు చాలా తక్కువ సాంద్రతలలో తరచుగా గమనించబడతాయి. 18

20 కి పైగా వేర్వేరు నెమటోడ్ జాతుల నుండి 200 కంటే ఎక్కువ వేర్వేరు అస్కరోసైడ్ నిర్మాణాలు గుర్తించబడ్డాయి, ఆస్కరోసైడ్లు నెమటోడ్లు 18 యొక్క అత్యంత సంరక్షించబడిన పరమాణు సంతకాన్ని సూచిస్తాయి. ఈ పురాతన నెమటోడ్ సంతకాన్ని గుర్తించి వాటికి ప్రతిస్పందించే మార్గాలను నెమటోడ్ల యొక్క మొక్క మరియు జంతువుల హోస్ట్‌లు, అలాగే నెమటోడ్-అనుబంధ సూక్ష్మజీవులు అభివృద్ధి చేశాయని ఈ పరిశోధనలు సూచించాయి. మట్టి-నివాస నెమటోడ్ల యొక్క సహజ మాంసాహారులైన నెమటోఫాగస్ శిలీంధ్రాలు, ఆస్కరోసైడ్లు 24, 25 కు ప్రతిస్పందనగా ప్రత్యేకమైన ఉచ్చు పరికరాల ఏర్పాటును ఇటీవల ప్రారంభించాయి.

ఈ అధ్యయనంలో, ఆస్కరోసైడ్లు మొక్కల ద్వారా గ్రహించబడతాయా లేదా మొక్కల-రక్షణ ప్రతిస్పందనలను మాడ్యులేట్ చేస్తాయా అని మేము పరిశోధించాము. మేము మొదట అనేక వ్యవసాయపరంగా ముఖ్యమైన మొక్కల-పరాన్నజీవి నెమటోడ్ల యొక్క ఆస్కరోసైడ్ ప్రొఫైల్‌లను వర్గీకరించాము, వీటిలో రూట్-నాట్ మరియు తిత్తి నెమటోడ్‌లు ఉన్నాయి, ఇవి రెండు అత్యంత నష్టపరిచే సమూహాలు 26 . మొక్క-పరాన్నజీవి మరియు ఇతర నెమటోడ్ల ద్వారా ఉత్పత్తి చేయబడిన ఆస్కరోసైడ్లు మొక్కల రోగనిరోధక శక్తిని ప్రభావితం చేస్తాయా అని మేము అంచనా వేసాము. SA- మరియు JA- మధ్యవర్తిత్వ సిగ్నలింగ్ మార్గాలతో సహా ఆకులు మరియు మూలాలలో సంరక్షించబడిన రక్షణ ప్రతిస్పందనలను ప్రేరేపించడానికి ఆస్కరోసైడ్లు కనుగొనబడ్డాయి. అంతేకాకుండా, ఆస్కరోసైడ్స్‌తో చికిత్స కొన్ని వైరల్, బ్యాక్టీరియా, ఫంగల్ మరియు ఓమైసెట్ వ్యాధికారకకణాలకు, అలాగే అరబిడోప్సిస్‌లో రూట్-నాట్ మరియు తిత్తి నెమటోడ్లకు నిరోధకతను పెంచుతుంది.

ఫలితాలు

మొక్క-పరాన్నజీవి నెమటోడ్లు ఆస్కరోసైడ్లను ఉత్పత్తి చేస్తాయి

మొక్కలు ఆస్కరోసైడ్లకు ప్రతిస్పందించే అవకాశాన్ని పరిశోధించడానికి, మేము మొదట అనేక రకాల మొక్కల-పరాన్నజీవి నెమటోడ్ల ద్వారా ఉత్పత్తి చేయబడిన ఆస్కరోసైడ్ ప్రొఫైళ్ళను వర్గీకరించాము. మూడు జాతుల రూట్-నాట్ నెమటోడ్లు, మెలోయిడోజైన్ అజ్ఞాత , ఎం. జవానికా మరియు ఎం. హాప్లా , అలాగే తిత్తి ( హెటెరోడెరా గ్లైసిన్స్ ) మరియు పుండు యొక్క మూడు జాతుల ఇన్ఫెక్టివ్ బాలబాలికల విసర్జించిన జీవక్రియ (' ఎక్సో- మెటాబోలోమ్') ను విశ్లేషించడానికి మేము మీడియా సూపర్నాటెంట్ నమూనాలను ఉపయోగించాము. ( ప్రటైలెన్చస్ బ్రాచ్యూరస్ ) నెమటోడ్లు, ఇటీవల అభివృద్ధి చేసిన సున్నితమైన మరియు ఎంపిక చేసిన మాస్ స్పెక్ట్రోమెట్రిక్ (ఎంఎస్) స్క్రీనింగ్ పద్ధతిని ఉపయోగించి 27 (Fig. 1). ఎక్సో- మెటాబోలోమ్ నమూనాల యొక్క MS విశ్లేషణ అన్ని విశ్లేషించబడిన జాతులలో ఇలాంటి అస్కరోసైడ్ల విసర్జనను వెల్లడించింది. మెలోయిడోజైన్ spp., Ascr # 18 లో, 11-కార్బన్ సైడ్ గొలుసును కలిగి ఉన్న సమ్మేళనం చాలా సమృద్ధిగా ఉంది, తరువాత పొడవైన కార్బన్ సైడ్ గొలుసులతో కూడిన సమ్మేళనాలు (Fig. 1a-c; అనుబంధ Fig. 1 మరియు అనుబంధ పట్టిక 1). విశ్లేషించిన మెలోయిడోజైన్ ఎస్పిపిలో ఆస్కార్ # 18 యొక్క సాంద్రతలు. సంస్కృతి మీడియా నమూనాలు వేరియబుల్ మరియు 5 nM నుండి 100 nM వరకు ఉన్నాయి. హెచ్. గ్లైసిన్స్ మరియు పి. బ్రాచ్యూరస్ మెటబోలోమ్ నమూనాల విశ్లేషణ కూడా మెలోయిడోజైన్ ఎస్పిపి కంటే తక్కువ మొత్తంలో ఉన్నప్పటికీ, ఆస్కార్ # 18 ను వెల్లడించింది. (అనుబంధ పట్టిక 1). వయోజన M. హాప్లా , హెచ్. గ్లైసిన్స్ మరియు పి. బ్రాచ్యూరస్ యొక్క ఎక్సో- మెటాబోలోమ్ నమూనాలు ఆస్కార్ # 18 యొక్క జాడ మొత్తాలను కలిగి ఉన్నాయి, అయితే ఇన్ఫెక్టివ్ బాల్యాలలో కనిపించే ఇతర అస్కరోసైడ్లు పెద్దవారిలో కనుగొనబడలేదు. ఈ ఫలితాలు మొక్కల-పరాన్నజీవి నెమటోడ్లు, గతంలో విశ్లేషించిన ఇతర నెమటోడ్ జాతుల మాదిరిగా, ఆస్కరోసైడ్లను ఉత్పత్తి చేస్తాయి. ముఖ్యంగా, మొక్క-పరాన్నజీవి నెమటోడ్ల యొక్క మూడు జాతుల నుండి విశ్లేషించబడిన జాతులు అన్నీ ascr # 18 ను అత్యంత సమృద్ధిగా ఉన్న ఆస్కరోసైడ్ గా ఉత్పత్తి చేస్తాయి. మోడల్ జీవి సి. ఎలిగాన్స్ 27 చేత ఉత్పత్తి చేయబడిన అస్కరోసైడ్ ప్రొఫైల్ యొక్క చిన్న భాగం అస్క్ర్ # 18 ను గతంలో గుర్తించారు మరియు దీనిని ఎంటోమోపాథోజెనిక్ నెమటోడ్లు 19, 20 ఉత్పత్తి చేస్తాయి.

Image

( ) సి. ఎలిగన్స్ మరియు ఇతర నెమటోడ్ జాతుల నుండి గతంలో గుర్తించిన ఆస్కరోసైడ్ల ఉదాహరణలు. ( బి ) M. హాప్లా ఎక్సో-మెటబోలోమ్ నమూనాల HPLC-MS విశ్లేషణ, m / z = [MH] కు అనుగుణమైన అస్కరోసైడ్ శిఖరంలో 100% వరకు అయాన్ క్రోమాటోగ్రామ్‌లను స్కేల్ చేసి చూపిస్తుంది - గుర్తించిన ఏడు ఆస్కరోసైడ్ల కోసం. ( సి ) హెచ్‌పిఎల్‌సి-ఎంఎస్ నిర్ణయించినట్లుగా గుర్తించబడిన ఆస్కరోసైడ్ల రసాయన నిర్మాణాలు మరియు సాపేక్ష పరిమాణాత్మక పంపిణీ. అధిక-రిజల్యూషన్ MS డేటా కోసం, అనుబంధ పట్టిక 1 చూడండి. M. అజ్ఞాత మరియు M. జావానికా యొక్క పరిమాణాత్మక అస్కరోసైడ్ ప్రొఫైల్స్ అనుబంధ అంజీర్ 1 లో చూపించబడ్డాయి.

పూర్తి పరిమాణ చిత్రం

Ascr # 18 రక్షణ ప్రతిస్పందనలను ప్రేరేపిస్తుంది మరియు ప్రతిఘటనను పెంచుతుంది

మొక్కల-పరాన్నజీవి నెమటోడ్ల యొక్క అన్ని విశ్లేషించబడిన జాతుల ద్వారా ఆస్కార్ # 18 ఉత్పత్తి చేయబడిందని కనుగొన్న ఆధారంగా, ఈ అస్కరోసైడ్ మొక్కలచే గ్రహించబడిందా మరియు విభిన్న వ్యాధికారకాలకు మొక్కల-రక్షణ ప్రతిస్పందనలను ప్రభావితం చేస్తుందా అని మేము అడిగారు. నెమటోడ్ సిగ్నలింగ్ అణువులుగా ఆస్కరోసైడ్లు నెమటోడ్ వ్యాధికారక కారకాలపై ప్రత్యక్ష ప్రభావాలను కలిగి ఉంటాయి, ఇవి ascr # 18 కు మొక్కల ప్రతిస్పందనలను గుర్తించడంలో గందరగోళానికి గురిచేస్తాయి, అరబిడోప్సిస్ యొక్క బాక్టీరియా ( సూడోమోనాస్ సిరంజి పివి. టమోటా) కు రక్షణ ప్రతిస్పందనలపై ఆస్కార్ # 18 ప్రభావాన్ని పరీక్షించడం ద్వారా మేము ప్రారంభించాము. ) మరియు వైరల్ వ్యాధికారక (టర్నిప్ క్రింకిల్ వైరస్ - TCV; Fig. 2). మొక్కలు సహజంగా వాటి మూలాల ద్వారా నెమటోడ్లను ఎదుర్కొంటాయి కాబట్టి, అరబిడోప్సిస్ మూలాలు పాక్షికంగా నీటిలో మునిగిపోతాయి, ఆస్క్ర్ # 18 యొక్క వివిధ సాంద్రతలను 24 గంటలకు 24 గంటలకు ఆకులు వ్యాధికారక కారకాలతో టీకాలు వేయడానికి ముందు. 1 μM ascr # 18 తో రూట్ చికిత్స వైరస్ P. సిరంజి యొక్క పెరుగుదలను తగ్గించింది, అయితే అధిక ascr # 18 గా ration త (5 μM) తక్కువ ప్రభావవంతంగా ఉంది (Fig. 2a). 1 μM వద్ద ascr # 18 తో రూట్ చికిత్స కూడా వైరస్ TCV (Fig. 2b-d, అనుబంధ Fig. 2.) కు నిరోధకతను పెంచింది. వైరల్ రెప్లికేషన్, ఆకులలోని వైరల్ కోట్ ప్రోటీన్ (సిపి) (Fig. 2b) ద్వారా కొలుస్తారు, టీకాలు వేయబడిన మరియు దూరపు ఆకులు రెండింటిలోనూ తగ్గించబడింది. అంతేకాకుండా, వైరస్ యొక్క దైహిక వ్యాప్తి దాదాపుగా రద్దు చేయబడింది, ఇది ascr # 18-ప్రీట్రీట్డ్ మొక్కల దూరపు ఆకులలో సిపి యొక్క జాడతో మాత్రమే ఉంది. టీకాలు వేసిన ఆకులపై క్లోరోసిస్ అభివృద్ధి, అంజీర్ 2 సి), ఆకు కర్లింగ్ / క్రింక్లింగ్ మరియు పుష్పగుచ్ఛము అభివృద్ధిని అణచివేయడం (Fig. 2d) వంటి వ్యాధి లక్షణాలు కూడా ascr # 18-ముందుగా చికిత్స చేయబడిన మొక్కలలో తగ్గించబడ్డాయి.

Image

( ) వైరస్ సూడోమోనాస్ సిరంజి పివికి మెరుగైన నిరోధకత. ascr # 18 తో 24 h కోసం రూట్ ప్రీట్రీట్మెంట్ తర్వాత టమోటా (Pst) DC3000. 3 dpi వద్ద బ్యాక్టీరియా పెరుగుదల అంచనా వేయబడింది డేటా సగటులు ± sd ( n ≥3). ( బి ) టీకాలు వేసిన (స్థానిక) మరియు మొక్కల యొక్క అన్‌నోక్యులేటెడ్ (దైహిక) ఆకులలో టిసివి సిపి యొక్క పరిమాణాన్ని ascr # 18 తో 24 గంటలకు ముందుగా చికిత్స చేస్తారు. యాంటీ-సిపి యాంటీబాడీతో ఇమ్యునోబ్లోట్ విశ్లేషణ కోసం ఆకులు 2, 3 మరియు 6 డిపిఐల వద్ద పండించబడ్డాయి. కూమాస్సీ బ్లూ స్టెయినింగ్ (సిబి) లోడింగ్ కంట్రోల్‌గా పనిచేసింది. ( సి ) టిసివి-టీకాలు వేసిన (స్థానిక) ఆకులు 6 డిపిఐ ( డి ) వద్ద తీయబడిన టిసివి-సోకిన మొక్కలు 6 డిపిఐ ( ) వద్ద ఛాయాచిత్రాలు తీయబడ్డాయి. ట్రాన్స్క్రిప్ట్ స్థాయిలు qRT-PCR చేత కొలవబడినట్లు రక్షణ-జన్యు గుర్తులను మొక్కల నుండి ఆకులు ascr # 18 (1 μM). జన్యు-ట్రాన్స్క్రిప్ట్ స్థాయిలు 6 hpt వద్ద నిర్ణయించబడ్డాయి మరియు 24 hpt డేటా సగటు ± sd ( n = 3). ( ఎఫ్ ) ascr # 18 తో ఆకు ప్రీట్రీట్మెంట్ తర్వాత అరబిడోప్సిస్ 10 మరియు 15 నిమిషాలలో MAPKs MPK3 మరియు MPK6 యొక్క క్రియాశీలత. CB లోడింగ్ కంట్రోల్‌గా పనిచేసింది. ( g ) qRT-PCR చేత కొలవబడినట్లుగా, ascr # 18 తో ఆకుల సిరంజి చొరబాటు తరువాత, వరుసగా SA మరియు JA మార్కర్ జన్యువుల PR-1 మరియు PDF1.2 యొక్క ప్రేరణ. internal- ట్యూబులిన్ అంతర్గత నియంత్రణగా ఉపయోగించబడింది. * పి ≤0.05; ** పి ≤0.005; *** పి ≤0.0005, రెండు తోక గల టి -టెస్ట్.

పూర్తి పరిమాణ చిత్రం

Ascr # 18 కు అరబిడోప్సిస్ యొక్క ప్రతిస్పందనను మరింత వివరించడానికి, ascr # 18 తో మూల చికిత్స తర్వాత వేర్వేరు సమయ బిందువులలో MAMP- ప్రేరేపిత రోగనిరోధక శక్తి (MTI) గుర్తులను మరియు ఆకుల రక్షణ-సంబంధిత జన్యువులను మేము పర్యవేక్షించాము. MAPK లు మరియు కాల్షియం-ఆధారిత ప్రోటీన్ కినేస్ 5, 28 మొక్కల ద్వారా MAMP లను గుర్తించడాన్ని నియంత్రించే సిగ్నలింగ్ మార్గాల యొక్క ముఖ్య భాగాలు. మేము MAPK- సంబంధిత Flg22 - INDUCED RECEPTOR KINASE1 ( FRK1 ) మరియు కాల్షియం-ఆధారిత ప్రోటీన్ కినేస్-సంబంధిత PHOSPHATE-INDUCED1 ( PHI1 ) MTI జన్యువుల 28 యొక్క ప్రేరణను కొలిచాము . Ascr # 18 తో మూలాల ముందస్తు చికిత్స FRK1 యొక్క ఆకులలో 6 h పోస్ట్ ట్రీట్మెంట్ (hpt) వద్ద మరియు PHI1 24 hpt (Fig. 2e) వద్ద పెరిగిన ట్రాన్స్క్రిప్ట్ స్థాయిలను ప్రేరేపించింది. అదనంగా, మొక్కల రోగనిరోధక శక్తి, SA మరియు JA మధ్యవర్తిత్వం చేసే రెండు ప్రధాన హార్మోన్ల కోసం ప్రతినిధి బయోసింథటిక్ లేదా ప్రతిస్పందించే జన్యువుల వ్యక్తీకరణ కూడా ప్రభావితమైంది. ASCr # 18 తో రూట్ ప్రీట్రీట్మెంట్ SA- ప్రతిస్పందించే జన్యువుల యొక్క వ్యక్తీకరణ PATHOGENESIS-RELATED-4 ( PR-4) మరియు GLUTATHIONE S-TRANSFERASEF6 (GSTF6), మరియు JA- బయోసింథెటిక్ జన్యువులు LIPOXYGENASE2 ( LOXXAE ) ఆకులలో (Fig. 2e) 6 .

JA మరియు SA సిగ్నలింగ్ ఇథిలీన్ (ET) మరియు ఆక్సిన్ సిగ్నలింగ్ మార్గాలతో సంకర్షణ చెందుతున్నందున, మేము అదనంగా ET సిగ్నలింగ్‌తో సంబంధం ఉన్న ఐదు జన్యువుల వ్యక్తీకరణలో మార్పులను పర్యవేక్షించాము, అలాగే 1 μM తో రూట్ చికిత్సకు ప్రతిస్పందనగా ఆక్సిన్ సిగ్నలింగ్‌తో సంబంధం ఉన్న ఐదు జన్యువులను. ascr # 18 at 24 hpt, పరీక్షించిన 10 జన్యువులలో, SAUR-LIKE AUXIN RESPONSE PROTEIN34 (SAUR34) యొక్క వ్యక్తీకరణ మాత్రమే మెరుగుపరచబడింది (అనుబంధ Fig. 3), ascr # 18 చికిత్స ఆక్సిన్- లేదా ET- నియంత్రిత రక్షణను తీవ్రంగా ప్రభావితం చేయదని సూచిస్తుంది సిగ్నలింగ్.

మొక్కలు ఆకుల ద్వారా ascr # 18 కు ప్రతిస్పందిస్తాయా అని మేము తరువాత అంచనా వేసాము. MTI (Fig. 2f, అనుబంధ Fig. 4) 5 అభివృద్ధికి ప్రారంభ గుర్తులు అయిన MAPK లు, MPK3 మరియు MPK6 యొక్క ascr # 18 యొక్క ప్రేరేపిత క్రియాశీలత యొక్క ఆకు చొరబాటు. PTE-pY మోటిఫ్ 29 యొక్క ఫాస్ఫోరైలేషన్‌ను గుర్తించే యాంటీబాడీని ఉపయోగించి ఇమ్యునోబ్లోట్ విశ్లేషణ ద్వారా MAPK క్రియాశీలతను పర్యవేక్షించారు. 1 μM ascr # 18 తో ఆకు చొరబడిన తరువాత 10 నిమిషాల్లో రెండు MAPK ల యొక్క ఫాస్ఫోరైలేషన్‌లో అస్థిరమైన పెరుగుదలను మేము గమనించాము. అదనంగా, ప్రోటోటైపిక్ SA- ప్రతిస్పందించే మార్కర్ PR-1 మరియు ప్రోటోటైపిక్ JA- ప్రతిస్పందించే PDF1.2 జన్యువులు 6 యొక్క ట్రాన్స్‌క్రిప్ట్‌లు 0.3 μM లేదా 1 μM ascr # 18 (Fig. 2g, అనుబంధ Fig. 5) తో చొరబడిన తరువాత 24 hpt వద్ద పెంచబడ్డాయి. . కలిసి చూస్తే, అరబిడోప్సిస్‌లో , ఆకులు లేదా మూలాలకు ascr # 18 అనువర్తనానికి ప్రతిస్పందనగా స్థానిక మరియు దైహిక రక్షణలు సక్రియం చేయబడిందని మా ఫలితాలు చూపుతున్నాయి.

Ascr # 18 డికాట్ మరియు మోనోకోట్ పంట మొక్కలలో నిరోధకతను పెంచుతుంది

మొక్కల రాజ్యంలో ఆస్కరోసైడ్ అవగాహన సంరక్షించబడిందో లేదో తెలుసుకోవడానికి మరియు యూకారియోటిక్ వ్యాధికారక నిరోధకతపై ప్రభావాలను పరీక్షించడానికి, మేము రక్షణ ప్రతిస్పందనలపై ఆస్కార్ # 18 యొక్క ప్రభావాన్ని కొలిచాము మరియు డికాట్స్ టొమాటో ( సోలనం లైకోపెర్సికం ) మరియు బంగాళాదుంప ( సోలనం ట్యూబెరోసమ్ ), అలాగే మోనోకోట్ బార్లీ ( హోర్డియం వల్గేర్ ). టమోటాలో, టీకాలు వేయడానికి ముందు 48 గంటలకు 1 nM మరియు 10 nM ascr # 18 తో మూలాలను ప్రీ-ట్రీట్మెంట్ చేయడం వలన ఓమిసైట్ వ్యాధికారక ఫైటోఫ్థోరా ఇన్ఫెస్టన్స్‌కు వ్యతిరేకంగా బలమైన రక్షణ లభిస్తుంది, ఇది స్ప్రాంజియా సంఖ్య మరియు గాయం పరిమాణంలో తగ్గింపు ద్వారా సూచించబడుతుంది (Fig. 3a, b, అనుబంధ Fig. 6). Pst కి అరబిడోప్సిస్ యొక్క నిరోధకతపై ascr # 18 యొక్క ప్రభావం మాదిరిగానే, టమోటాలో P. ఇన్ఫెస్టాన్లకు వ్యతిరేకంగా రక్షణ ascr # 18 యొక్క అధిక సాంద్రతలలో తగ్గింది. ఏదేమైనా, గరిష్ట రక్షణ ascr # 18 సాంద్రతలలో (1–10 nM, Fig. 3a) గమనించబడింది, ఇది అరబిడోప్సిస్ (1 μM, Fig. 2a) కంటే చాలా తక్కువ. 10 nM వద్ద ascr # 18 తో రూట్ ప్రీట్రీట్మెంట్ టమోటా ఆకులలో Pst యొక్క పెరుగుదలను తగ్గించింది (Fig. 3c), అయితే అధిక సాంద్రతలు చాలా తక్కువ ప్రభావంతో ఉన్నాయి (అనుబంధ Fig. 7). ఆస్కార్ # 18 తో టమోటా యొక్క మూల చికిత్స ఆకులు ట్రాన్స్క్రిప్ట్స్ పేరుకుపోవడాన్ని ప్రేరేపించింది (i) ట్రాన్స్క్రిప్షన్ కారకం GRAS4 , టమోటా 30 లోని అబియోటిక్- మరియు బయోటిక్-స్ట్రెస్ స్పందనలతో అనుసంధానించబడిన MTI యొక్క తెలిసిన మార్కర్, (ii) SA- ప్రతిస్పందించే జన్యువులు GST మరియు β-1, 3-GLUCANASE మరియు (iii) JA- బయోసింథసిస్ జన్యువు AOS2 (Fig. 3d) 6 . నాలుగు జన్యువులకు ట్రాన్స్క్రిప్ట్ స్థాయిలు గణనీయంగా 48 హెచ్‌టిపి వద్ద పెంచబడ్డాయి, h -1, 3-గ్లూకనాస్ కూడా 24 హెచ్‌టిపి వద్ద మెరుగైన స్థాయిలను ప్రదర్శిస్తుంది 10 ఎన్‌ఎమ్ ఆస్కార్ # 18 తో ప్రీట్రీట్మెంట్ రూట్ స్నానం ద్వారా లేదా టీకాలు వేయడానికి 48 గంటలు ముందు ఫోలియర్ స్ప్రే ద్వారా కూడా రక్షణ కల్పించింది బంగాళాదుంప యొక్క మూడు సాగులలో వైరస్ పి. ఇన్ఫెస్టాన్లకు వ్యతిరేకంగా (అనుబంధ Fig. 8).

Image

( ) టమోటా సివి ఆకులలో ఫైటోఫ్తోరా ఇన్ఫెస్టన్స్ (యుఎస్ 22) కు మెరుగైన నిరోధకత యొక్క మోతాదు ఆధారపడటం. M82 రూట్ టీకాలు వేయడానికి ముందు 48 గంటలకు అస్క్ర్ # 18 తో ముందే చికిత్స చేయబడింది. వ్యాధి తీవ్రతను అంచనా వేయడానికి స్పోరంగియా సంఖ్యలు 6 డిపిఐ వద్ద లెక్కించబడ్డాయి. డేటా సగటు ± sd ( n = 16). ( బి ) టమోటా సివిలో పి. ఇన్ఫెస్టన్స్ వల్ల కలిగే ప్రాంతం. M82 ఆకులు 6 dpi ( సి ) వద్ద ఫోటో తీయబడ్డాయి టమోటా సివిలో Pst DC3000 కు మెరుగైన నిరోధకత. M82 రూట్ 48 గంటలకు ascr # 18 తో ముందే చికిత్స చేయబడింది. 4 dpi వద్ద బ్యాక్టీరియా పెరుగుదల అంచనా వేయబడింది డేటా సగటు ± sd ( n = 6). ( డి ) ascr # 18 తో రూట్ ప్రీట్రీట్మెంట్ తర్వాత టొమాటో ఆకులు 24 మరియు 48 గంలలో రక్షణ-ప్రతిస్పందన జన్యువుల ప్రేరణ (వివరాల కోసం Fig. 2e లెజెండ్ చూడండి). డేటా సగటు ± sd ( n = 3). * పి ≤0.05; ** పి ≤0.005; *** పి ≤0.0005, రెండు తోక గల టి -టెస్ట్.

పూర్తి పరిమాణ చిత్రం

మోనోకాట్స్‌లో ascr # 18 రక్షణ ప్రతిస్పందనలను సక్రియం చేస్తుందో లేదో పరీక్షించడానికి, బార్లీ ఆకులు ( హోర్డియం వల్గేర్ ) వైరస్ ఫంగల్ వ్యాధికారక బ్లూమెరియా గ్రామినిస్ f తో టీకాలు వేయడానికి ముందు ascr # 18 48 h తో పిచికారీ చేయబడ్డాయి. sp. hordei ( Bgh ). విస్తృత శ్రేణి ascr # 18 సాంద్రతలతో (0.01–1 μM) ముందస్తు చికిత్స Bgh కు నిరోధకతను పెంచింది , ఆకులపై ఏర్పడిన స్ఫోటముల సంఖ్య తగ్గిన ఆధారంగా (Fig. 4a). ఈ ముందస్తు చికిత్స PR-1 ట్రాన్స్క్రిప్ట్ చేరడం కూడా ప్రేరేపించింది; ascr # 18-ప్రీట్రీట్డ్ ఆకులలో ఇంకా ఎక్కువ స్థాయి PR-1 వ్యక్తీకరణ గమనించబడింది, తరువాత వాటిని Bgh తో టీకాలు వేయించారు , బార్లీలో (Fig. 4b) ascr # 18 యొక్క ప్రాధమిక ప్రభావాన్ని సూచిస్తుంది. కలిసి చూస్తే, మా ఫలితాలు ascr # 18 ను మోనోకోట్లు మరియు డికాట్లచే గ్రహించబడిందని మరియు నాలుగు ప్రధాన తరగతుల వ్యాధికారక క్రిములకు వ్యతిరేకంగా ప్రతిఘటనను పెంచే రక్షణ ప్రతిస్పందనలను ప్రేరేపిస్తుందని చూపిస్తుంది.

Image

( ) బ్లూమెరియా గ్రామినిస్‌కు బార్లీ నిరోధకతపై ఆస్కార్ # 18 తో ఆకు ప్రీట్రీట్మెంట్ ప్రభావం. sp. hordei ( Bgh ). టీకాలు వేసే ముందు 48 గంటలు ఆస్క్ర్ # 18 పరిష్కారాలతో ఆకులు పిచికారీ చేయబడ్డాయి. Bgh స్ఫోటములు 7 dpi వద్ద లెక్కించబడ్డాయి డేటా సగటు ± sd ( n = 10). ( బి ) ascr # 18 తో ఆకు పూర్వ చికిత్స ద్వారా PR-1 వ్యక్తీకరణ యొక్క ప్రేరణ. మొక్కలను Bgh 48 h పోస్ట్ ప్రీట్రీట్మెంట్తో టీకాలు వేయించారు మరియు qRT-PCR విశ్లేషణ కోసం ఆకులను 16 hpi వద్ద సేకరించారు. డేటా సగటు ± sd ( n = 3). ( సి ) చక్కెర-దుంప తిత్తి నెమటోడ్ ( హెచ్. షాచ్టి ) కు అరబిడోప్సిస్ ససెప్టబిలిటీపై ఆస్కార్ # 18 ప్రభావం. టీకాలు వేయడానికి ముందు పది రోజుల వయసున్న అరబిడోప్సిస్ మొలకలను 48 గంటలకు బఫర్ లేదా 0.01 మరియు 0.3 μM అస్క్ర్ # 18 తో ప్రీ-ట్రీట్ చేశారు, ప్రతి మొలకలకి 200 కొత్తగా పొదిగిన మరియు ఉపరితల-క్రిమిరహిత బాల్యంతో. టీకాలు వేసిన 4 వారాల తరువాత ఆడవారి సంఖ్యను లెక్కించారు. ( డి ) రూట్-నాట్ నెమటోడ్ ( M. అజ్ఞాత ) కు అరబిడోప్సిస్ ససెప్టబిలిటీపై ascr # 18 ప్రభావం. టీకాలు వేసే ముందు పది రోజుల వయసున్న అరబిడోప్సిస్ మొలకలను 48 గంటలకు సూచించిన ఆస్కార్ # 18 సాంద్రతలతో ప్రీ-ట్రీట్ చేశారు, ప్రతి మొలకలకు ∼ 300 తాజాగా పొదిగిన మరియు ఉపరితల-క్రిమిరహిత బాల్యంతో. టీకాలు వేసిన 6 వారాల తరువాత సూక్ష్మదర్శిని క్రింద గాల్స్ సంఖ్యను లెక్కించారు. డేటా సగటు ± sd ( n = 5). (* P ≤0.05; ** P ≤0.005; *** P ≤0.0005, రెండు తోక గల t -test).

పూర్తి పరిమాణ చిత్రం

Ascr # 18 నెమటోడ్లకు అరబిడోప్సిస్ యొక్క నిరోధకతను పెంచుతుంది

తరువాత, మొక్క-పరాన్నజీవి నెమటోడ్ల ద్వారా అరబిడోప్సిస్ యొక్క ascr # 18 కు రూట్ ఎక్స్పోజర్ ప్రభావితమైందా అని మేము పరీక్షించాము. Ascr # 18 సాంద్రతల శ్రేణిని ఉపయోగించి, 10 nM ascr # 18 తో మూలాలను ముందస్తుగా చికిత్స చేయడం వల్ల తిత్తి ( H. Schachtii ) మరియు రూట్-నాట్ ( M. అజ్ఞాత ) నెమటోడ్లతో అరబిడోప్సిస్ సంక్రమణను గణనీయంగా తగ్గించినట్లు మేము కనుగొన్నాము (Fig. 4c, d), ascr # 18 యొక్క అధిక సాంద్రతలు ప్రభావవంతంగా లేవు. అస్కిర్ # 18 యొక్క నానోమోలార్ సాంద్రతలతో అరబిడోప్సిస్ చికిత్స రక్షణ-సంబంధిత జన్యువుల PHI1 , FRK1 మరియు WRKY53 యొక్క మూల వ్యక్తీకరణను ప్రభావితం చేసిందా అని మేము అంచనా వేసాము , ఇది రోగనిరోధక-మాడ్యులేటింగ్ ట్రాన్స్క్రిప్షన్ కారకాన్ని సంకేతం చేస్తుంది. మూడు జన్యువులు 10 లేదా 50 nM ascr # 18 కు బహిర్గతం అయిన 6 గంటలలోపు ప్రేరేపించబడిందని మేము కనుగొన్నాము, అయితే అధిక సాంద్రతకు (300 nM) బహిర్గతం ప్రభావం లేదా తగ్గిన వ్యక్తీకరణ లేదు (అనుబంధ Fig. 9).

ఇతర ఆస్కరోసైడ్లకు మొక్కల ప్రతిస్పందనలు

మొక్కలు అస్కరోసైడ్లకు సమ్మేళనం తరగతిగా ప్రతిస్పందిస్తాయో లేదో అంచనా వేయడానికి, రక్షణ ప్రతిస్పందనలను ప్రేరేపించే సామర్థ్యం కోసం మేము మూడు అదనపు అస్కరోసైడ్లను పరీక్షించాము. దీని కోసం మేము ascr # 3 ను ఎంచుకున్నాము, ఇది సైడ్ గొలుసులో సంయోగం చేయబడిన డబుల్ బాండ్, అలాగే ascr # 9 మరియు oscr # 9 ను కలిగి ఉంటుంది, ఇవి రెండూ ascr # 18 (11) కన్నా చాలా తక్కువ సైడ్ చైన్ (5 కార్బన్) కలిగి ఉంటాయి. కార్బన్లు, Fig. 1a) 17 . Ascr # 18 మాదిరిగానే, ascr # 3 లేదా ascr # 9 తో అరబిడోప్సిస్ యొక్క ఆకు చొరబాటు ప్రోటోటైపిక్ SA- ప్రతిస్పందించే PR-1 మరియు JA- ప్రతిస్పందించే PDF1.2 జన్యువుల యొక్క ప్రేరేపిత వ్యక్తీకరణ, అయితే oscr # 9 ప్రభావం చూపలేదు (అనుబంధ పట్టిక 2 ). అంతేకాకుండా, ascr # 18 తో టమోటా యొక్క రూట్ ప్రీట్రీట్మెంట్, P. ఇన్ఫెస్టాన్లకు మెరుగైన ప్రతిఘటన, అయితే ascr # 3 లేదా oscr # 9 పరీక్షించిన ఏకాగ్రత వద్ద నిరోధకతను ప్రభావితం చేయలేదు. ఈ ఫలితాలు మొక్కలు నిర్మాణాత్మకంగా విభిన్నమైన అస్కరోసైడ్‌లకు ప్రతిస్పందిస్తాయని చూపిస్తాయి, అయితే ఆ ప్రతిస్పందనలు నిర్మాణంలో మరియు జాతులపై ఆధారపడి ఉంటాయి. ముఖ్యంగా, ఆస్కార్ # 9, అస్కార్లోజ్కు సైడ్ చైన్ యొక్క అటాచ్మెంట్ యొక్క స్థితిలో మాత్రమే ఆస్కార్ # 9 నిర్మాణానికి భిన్నంగా ఉంటుంది, అన్ని పరీక్షల్లోనూ నిష్క్రియాత్మకంగా ఉంటుంది, అయితే ఆస్కార్ # 9 చురుకుగా ఉంది. అస్కరోసైడ్ల యొక్క యాంటీ బాక్టీరియల్ లేదా యాంటీ ఫంగల్ చర్యల వల్ల వ్యాధికారక నిరోధకత పెరిగినట్లు కనిపించే అవకాశం లేదు. మునుపటి అధ్యయనం ప్రకారం సి. ఎలిగాన్స్ మెటబోలోమ్ శాంపిల్స్‌లో మైక్రోమోలార్ నుండి మిల్లీమోలార్ సాంద్రత కలిగిన ఆస్కరోసైడ్‌లు యాంటీ-సూక్ష్మజీవుల చర్యను కలిగి ఉండవు.

చర్చా

నెమటోడ్లకు ప్రత్యేకమైన చిన్న అణువుల తరగతి అస్కరోసైడ్లు మొక్కలచే సంరక్షించబడిన విదేశీ పరమాణు సంతకంగా గుర్తించబడుతున్నాయని మా పని చూపిస్తుంది. ఫ్లాగెల్లిన్ 2, 28, 32 వంటి MAMP ల యొక్క ప్రభావాలకు సారూప్యంగా, మొక్కలచే ఆస్కరోసైడ్లను 'నెమటోడ్-అనుబంధ పరమాణు నమూనాలు' గా గ్రహించడం సంరక్షించబడిన రోగనిరోధక ప్రతిస్పందనలను క్రియాశీలపరచుటకు దారితీస్తుంది, దీని ఫలితంగా వ్యాధికారక మరియు తెగుళ్ళ యొక్క విస్తృత-స్పెక్ట్రంకు నిరోధకత పెరుగుతుంది. మొక్కలు-పరాన్నజీవి నెమటోడ్లలో అత్యంత సమృద్ధిగా ఉన్న అస్కరోసైడ్, మొక్కలు చాలా తక్కువ సాంద్రతలతో, MAMP లు 2, 33 యొక్క అవగాహనకు అవసరమయ్యే మాదిరిగానే స్పందిస్తాయి, మొక్కలు అస్కరోసైడ్ అవగాహన కోసం నిర్దిష్ట గ్రాహక (ల) ను అభివృద్ధి చేశాయని సూచిస్తున్నాయి. బ్యాక్టీరియా MAMP ల మాదిరిగానే, మొక్కల జాతుల మధ్య ఆస్కరోసైడ్లకు సున్నితత్వం వైవిధ్యంగా ఉంటుంది: టమోటా, బంగాళాదుంప మరియు బార్లీలో 10 nM ascr # 18 బలంగా రక్షణ-జన్యు వ్యక్తీకరణ మరియు మెరుగైన ప్రతిఘటనను ప్రేరేపించింది, అయితే అరబిడోప్సిస్‌కు ఎక్కువ సాంద్రతలు అవసరం. ముఖ్యంగా, అరబిడోప్సిస్ మరియు టమోటా రెండింటిలోనూ, అత్యధికంగా పరీక్షించిన ఆస్కార్ # 18 సాంద్రతలలో సమర్థత తగ్గింది. ఉదాహరణకు, టమోటా ఆస్కార్ # 18 సాంద్రతలు 1–10 nM పి. ఇన్ఫెస్టాన్లకు గరిష్ట నిరోధకతను అందించాయి, అయితే ప్రతిఘటన యొక్క మెరుగుదల 100 nM వద్ద తగ్గింది లేదా కోల్పోయింది.

నెమటోడ్లలో ఆస్కరోసైడ్-మధ్యవర్తిత్వ సమలక్షణాల కోసం అధిక సాంద్రతలలో ఇదే విధమైన కార్యాచరణ తగ్గుతుంది. ఉదాహరణకు, మగ సి. ఎలిగన్స్‌ను హెర్మాఫ్రోడైట్-ఉత్పత్తి చేసిన అస్కరోసైడ్‌ల పట్ల ఆకర్షించడం, అలాగే ఇండోల్ అస్కరోసైడ్స్‌కు ప్రతిస్పందనగా సి . అధిక అస్కరోసైడ్ సాంద్రతలలో కార్యకలాపాలు తగ్గడానికి కారణం తెలియదు. ఏది ఏమయినప్పటికీ, చిన్న-అణువు లిగాండ్ల యొక్క అధిక సాంద్రతలు గ్రాహకాల యొక్క ఉత్పాదకత లేని నిశ్చితార్థానికి కారణమవుతాయని సూచించబడింది, ఉదాహరణకు, రిసెప్టర్ డైమర్స్ 35 ఏర్పడటంలో జోక్యం చేసుకోవడం ద్వారా, సి. ఎలిగాన్స్ 36 లోని ఆస్కరోసైడ్ అవగాహనకు ఇది అవసరమని తేలింది.

అరబిడోప్సిస్‌లోని రూట్-నాట్ మరియు సిస్ట్ నెమటోడ్స్‌తో (10 nM) రూట్ ఇన్‌ఫెక్షన్‌కు వ్యతిరేకంగా ఉత్తమమైన రక్షణను అందించే ascr # 18 గా ration త పరీక్షించిన బ్యాక్టీరియా మరియు వైరల్ వ్యాధికారక (1 μM) తో ఆకు సంక్రమణకు వ్యతిరేకంగా ఉత్తమ రక్షణ కోసం అవసరమైన ఏకాగ్రత కంటే చాలా తక్కువ. ఇది మూలాలలో ఆస్కరోసైడ్ గ్రాహకాల యొక్క అధిక వ్యక్తీకరణను ప్రతిబింబిస్తుంది లేదా ascr # 18 అప్లికేషన్ లేదా అవగాహన యొక్క సైట్ నుండి సంక్రమణ ప్రదేశాల మధ్య దూరాలలో తేడాలు. అదనంగా, నెమటోడ్ సంక్రమణ స్థాయిలను గమనించిన తగ్గింపు ఈ నెమటోడ్ జాతులపై ascr # 18 యొక్క ప్రత్యక్ష ప్రభావాల వల్ల కావచ్చు, అవి పరిశోధించబడుతున్నాయి. ఏది ఏమయినప్పటికీ, సమర్థవంతమైన ascr # 18 ఏకాగ్రత వద్ద మూలాలలో రక్షణ-అనుబంధ జన్యువుల ప్రేరణ, పెరిగిన ప్రతిఘటన కనీసం కొంతవరకు, మెరుగైన రోగనిరోధక శక్తి ద్వారా మధ్యవర్తిత్వం వహించాలని సూచిస్తుంది. ఆస్కార్ # 18 యొక్క నానోమోలార్ సాంద్రతలు విశ్లేషించబడిన మొక్క-పరాన్నజీవి నెమటోడ్ జాతుల సంస్కృతి మీడియా నమూనాలలో కనిపించే వాటికి ప్రతినిధులు, మొక్క-నెమటోడ్ పరస్పర చర్యలలో ఆస్కార్ # 18 యొక్క జీవ ప్రాముఖ్యతకు మద్దతు ఇస్తాయి.

రూట్ అప్లికేషన్ తరువాత ఆకుల రక్షణ జన్యువుల యొక్క దైహిక ప్రేరణ మరియు వ్యాధికారక నిరోధకత సూచిస్తుంది ascr # 18 స్వయంగా (లేదా ascr # 18 యొక్క మెటాబోలైట్) మూలాల నుండి ఆకుల వైపుకు కదులుతుంది మరియు / లేదా ascr # 18 మొబైల్ సిగ్నల్ యొక్క సంశ్లేషణను ప్రేరేపిస్తుంది రోగనిరోధక ప్రతిస్పందనలను సక్రియం చేయడానికి ఆకులు ప్రయాణించే మూలాలలో. రూట్-ట్రీట్డ్ ప్లాంట్స్ యొక్క ఆకు కణజాలంలో మేము ascr # 18 ను గుర్తించలేకపోయాము, కాని ఇది ఇప్పటికే పరీక్షల్లో ఉపయోగించిన ascr # 18 యొక్క చాలా తక్కువ సాంద్రతలను పరిమితం చేయడం వల్ల కావచ్చు. మొక్కలు ప్రధానంగా అస్కరోసైడ్లను వాటి మూలాల ద్వారా ఎదుర్కొంటున్నప్పటికీ, ఆకు చొరబాటు మరియు తక్కువ ఆస్కార్ # 18 సాంద్రతలతో ఆకులు చల్లడం కూడా రక్షణ ప్రతిస్పందనలను ప్రేరేపించడంలో ప్రభావవంతంగా ఉన్నాయి. ఆకు కణజాలంలో ఆస్కరోసైడ్ గ్రాహకాలు కూడా ఉన్నాయని ఈ పరిశోధన సూచిస్తుంది. ఆస్కరోసైడ్లకు మొక్కల ప్రతిస్పందనల యొక్క మరింత వర్గీకరణ మరియు కాగ్నేట్ గ్రాహకాల యొక్క గుర్తింపు మొక్కల రోగనిరోధక శక్తిని ప్రేరేపించడంలో నెమటోడ్-అనుబంధ పరమాణు నమూనాలు, MAMP లు మరియు ఇతర పరమాణు నమూనాల అవగాహన ఎలా కలుస్తుందో తెలుస్తుంది. మొక్కల రోగనిరోధక ప్రతిస్పందనలను సక్రియం చేయడానికి ఆస్కరోసైడ్లు వంటి చిన్న-అణువుల సంకేతాలను ఉపయోగించడం వ్యవసాయం యొక్క ఆర్థిక మరియు పర్యావరణ స్థిరత్వాన్ని మెరుగుపరచడంలో సహాయపడుతుంది.

పద్ధతులు

వార్మ్ నమూనా తయారీ

నెమటోడ్ గుడ్లు ( M. హాప్లా స్ట్రెయిన్ VW9, M. అజ్ఞాత VW6, M. జవానికా VW4 మరియు P. బ్రాచ్యూరస్ ) గ్రీన్హౌస్-పెరిగిన టమోటా మొక్కల నుండి సేకరించబడ్డాయి మరియు బ్రాంచ్ మరియు ఇతరులలో వివరించిన విధంగా ఉపరితల-శుభ్రమైన బాలలను తయారు చేశారు. 37 . గ్రీన్హౌస్-పెరిగిన సోయాబీన్పై హెచ్. గ్లైసిన్లను పెంచారు. H 30, 000–100, 000 కొత్తగా పొదిగిన చిన్నపిల్లల బ్యాచ్‌లు 24 మి.లీ కోసం 8 మి.లీ శుభ్రమైన నీటిలో భ్రమణంతో పొదిగేవి. క్లుప్త సెంట్రిఫ్యూజేషన్ తరువాత, సూపర్నాటెంట్ 22-μm ఫిల్టర్ ద్వారా ఫిల్టర్ చేయబడి స్తంభింపజేయబడింది. ఫిల్టర్ చేసిన సూపర్‌నాటెంట్లు మరియు పురుగు గుళికలను లైయోఫైలైజ్ చేశారు, ఒక్కొక్కటి 2 × 5 మి.లీ మిథనాల్‌తో తీయబడి పత్తి ఉన్నిపై ఫిల్టర్ చేయబడ్డాయి. సారం శూన్యంలో కేంద్రీకృతమై ఉంది మరియు ఫలితంగా అవశేషాలు 150 μl మిథనాల్‌లో తిరిగి ఇవ్వబడ్డాయి మరియు MS విశ్లేషణకు ముందు ఫిల్టర్ చేయబడ్డాయి.

MS విశ్లేషణ

తక్కువ-రిజల్యూషన్ కలిగిన HPLC-MS మరియు HPLC-MS / MS ఎజిలెంట్ ఎక్లిప్స్ XDB-C18 కాలమ్ (9.4 × 250 మిమీ, 5 μm కణ వ్యాసం) కలిగి ఉన్న ఎజిలెంట్ 1100 సిరీస్ హెచ్‌పిఎల్‌సి వ్యవస్థను ఉపయోగించి ప్రదర్శించారు మరియు డయోడ్ అర్రే డిటెక్టర్ ద్వారా కనెక్ట్ చేయబడింది క్వాట్రో II మాస్ స్పెక్ట్రోమీటర్ (మైక్రోమాస్ / వాటర్స్) 10: 1 స్ప్లిట్ ఉపయోగించి. 0.1% ఎసిటిక్ ఆమ్లం - అసిటోనిట్రైల్ ద్రావణి ప్రవణత 3.6 ml min −1 ప్రవాహం రేటుతో ఉపయోగించబడింది, ఇది 5 నిమిషాలకు 5% అసిటోనిట్రైల్ కంటెంట్‌తో ప్రారంభమై 40 నిమిషాల వ్యవధిలో 100% కి పెరిగింది. నెమటోడ్ మెటాబోలైట్ సారం (పైన వివరించిన విధంగా తయారుచేయబడింది) మరియు సింథటిక్ నమూనాలను (అనుబంధ పద్ధతులు మరియు వాన్ రౌస్ మరియు ఇతరులు 27 చూడండి ) HPLC-ESI-MS చేత ప్రతికూల మరియు సానుకూల అయాన్ మోడ్లలో 3.5 kV యొక్క కేశనాళిక వోల్టేజ్ మరియు కోన్ వోల్టేజ్ ఉపయోగించి విశ్లేషించారు. వరుసగా −40 మరియు +20 వి. M / z = 73.0 (నెగటివ్ మోడ్) యొక్క పూర్వగామి అయాన్ల కోసం HPLC-MS / MS స్క్రీనింగ్ మరియు 130.0 (పాజిటివ్ మోడ్) యొక్క తటస్థ నష్టం ఆర్గాన్‌ను 2.1 mtorr మరియు 30 eV వద్ద ఘర్షణ వాయువుగా ఉపయోగించి ప్రదర్శించారు. గుర్తించిన సమ్మేళనాల ఎలిమెంటల్ కూర్పును ధృవీకరించడానికి, వాటర్స్ అక్విటీ యుపిఎల్‌సి హెచ్‌ఎస్‌ఎస్ సి -18 కాలమ్ (2.1 × 100 మిమీ, 1.8 particm కణ వ్యాసం) తో అనుసంధానించబడిన వాటర్స్ నానోఅక్క్యూటీ యుపిఎల్‌సి వ్యవస్థను ఉపయోగించి, అధిక-రిజల్యూషన్ మాస్ స్పెక్ట్రోమెట్రీ ద్వారా నమూనాలను అదనంగా విశ్లేషించారు. Xevo G2 QTof మాస్ స్పెక్ట్రోమీటర్. MS డేటా సేకరణ మరియు ప్రాసెసింగ్ కోసం మాస్‌లింక్స్ సాఫ్ట్‌వేర్ ఉపయోగించబడింది.

మొక్కల పదార్థం మరియు పెరుగుదల పరిస్థితులు

పేర్కొనకపోతే, అరబిడోప్సిస్ థాలియానా ఎకోటైప్ కల్ -0, టమోటా ( సోలనం లైకోపెర్సికం) సాగు M82 మరియు బంగాళాదుంప ( ఎస్. ట్యూబెరోసమ్) సాగులు దేశీరీ, ఎవా మరియు యుకాన్ బంగారు మొక్కలను 16-హెచ్ లైట్ / 8-హెచ్ చీకటి ( 22 ° C) పాలన మరియు 70% సాపేక్ష ఆర్ద్రత. టొమాటో మరియు బంగాళాదుంప మొక్కలను 3 వారాల పాటు గ్రోత్ ఛాంబర్లలో పెంచారు మరియు తరువాత వాటిని ఉపయోగించే వరకు గ్రీన్హౌస్ పరిస్థితులకు బదిలీ చేశారు.

ఆస్కరోసైడ్ చికిత్సలు

మిల్లీమోలార్ స్టాక్ సొల్యూషన్స్ తయారు చేయడానికి అస్కరోసైడ్లు ఇథనాల్‌లో కరిగిపోయాయి. ప్రయోగం జరిగిన రోజున తుది సజల ఆస్కరోసైడ్ పలుచనలను తాజాగా తయారు చేశారు. నియంత్రణ పరిష్కారాలలో సమాన మొత్తంలో ఇథనాల్ ఉంటుంది (చాలా ప్రయోగాలకు <0.1%). మూల చికిత్స కోసం, మొక్కల కుండలను నియంత్రణ ద్రావణం లేదా ఆస్కార్ # 18 తో భర్తీ చేసిన నీటితో కూడిన ట్రేలో ఉంచారు. ఆకు చికిత్స కోసం, 3.5 వారాల వయస్సు గల అరబిడోప్సిస్ మొక్కల యొక్క మూడు ఆకులు సిరంజిని బఫర్ (బిస్-ట్రిస్ పిహెచ్ 6.5) తో చొరబడి, ఆస్కార్ # 18 యొక్క ఇథనాలిక్ ద్రావణంతో లేదా సమానమైన ఇథనాల్ కలిగిన బఫర్‌తో భర్తీ చేయబడ్డాయి. స్ప్రే చికిత్స కోసం, ఆకులు సజల 0.02% మధ్య -20 ద్రావణంతో పిచికారీ చేయబడ్డాయి, దీనికి ఆస్కార్ # 18 యొక్క ఇథనాల్ ద్రావణం లేదా ఇథనాల్ (నియంత్రణ) జోడించబడ్డాయి.

MAPK యాక్టివేషన్ / ఫాస్ఫోరైలేషన్

వివిధ సమయ బిందువులలో ascr # 18- చికిత్స మరియు మాక్-ట్రీట్డ్ ప్లాంట్ల నుండి ఆకు డిస్కులను సేకరించారు. 50 μl 4 × SDS ప్రోటీన్ నమూనా బఫర్‌ను జోడించే ముందు ఆకు కణజాలం ద్రవ నత్రజని మరియు భూమిలో చక్కటి పొడిలో స్తంభింపచేయబడింది. మొత్తం సెల్యులార్ ప్రోటీన్లు 8% SDS-PAGE లో ఎలెక్ట్రోఫోరేసిస్ ద్వారా వేరు చేయబడ్డాయి. ఫాస్ఫర్- p44 / 42 MAPK (క్యాట్ నం. # యాంటీబాడీ 9101, సెల్ సిగ్నలింగ్ టెక్నాలజీ) కు వ్యతిరేకంగా పాలిక్లోనల్ ప్రాధమిక ప్రతిరోధకాలను 1: 1, 000 పలుచనలను ఉపయోగించి ఇమ్యునోబ్లోట్ విశ్లేషణల ద్వారా MAPK క్రియాశీలతను గుర్తించారు, ఇది క్రియాశీలతకు కారణమైన pTE-pY మూలాంశం యొక్క ఫాస్ఫోరైలేషన్‌ను కనుగొంటుంది.

మొక్కల సంక్రమణ పరీక్షలు

బ్యాక్టీరియా పెరుగుదల పరీక్షల కోసం, 3.5 వారాల వయస్సు గల ascr # 18-ప్రీట్రీట్డ్ మరియు మాక్-ప్రీట్రీట్డ్ అరబిడోప్సిస్ మొక్కల యొక్క 3 ఆకులు 1 × 10 5 కాలనీ-ఏర్పడే సాంద్రతతో 10 mM MgCl 2 లో వైరస్ Pst DC3000 ను సస్పెన్షన్‌తో చొరబడ్డాయి. యూనిట్లు (cfu) ml −1 లేదా 10 mM MgCl 2 తో మాత్రమే నియంత్రణగా ఉంటాయి. టియాన్ మరియు ఇతరులలో వివరించిన విధంగా అరబిడోప్సిస్‌లో 3 రోజుల పోస్ట్ ఇనాక్యులేషన్ (డిపిఐ) బాక్టీరియల్ లెక్కింపు జరిగింది. 38 . క్లుప్తంగా, 0.7 సెం.మీ. వ్యాసం కలిగిన 3 ఆకు డిస్కులను 3 మొక్కల నుండి సేకరించి ఒకే గొట్టంలో ఉంచారు, 1 ప్రతిరూపంగా పనిచేస్తున్నారు. 1-ml 10-mM MgCl 2 ను ఉపయోగించి బ్యాక్టీరియా రికవరీ తరువాత, సీరియల్ డిల్యూషన్స్ మరియు లేపనాన్ని ప్రదర్శించారు. మొత్తం మీద, ప్రతి గొట్టం నుండి 20 μl ను 10-mM MgCl 2 యొక్క 180 μl కలిగి ఉన్న మైక్రోటైట్రే ప్లేట్ యొక్క బావులలో చేర్చారు, మరియు సీరియల్ 10-రెట్లు పలుచనలను బహుళ-ఛానల్ పైపెట్‌తో తయారు చేశారు. ప్రతి పలుచన నుండి 5 μl చుక్కలు 150-మిమీ పెట్రీ ప్లేట్ ఎల్బిలో రిఫాంపిసిన్ కలిగివుంటాయి, మరియు ప్లేట్లు 28 ° C వద్ద పొదిగేవి. పొదిగే తర్వాత 48 గంటలు బాక్టీరియల్ గణనలు జరిగాయి. కాంగ్ మరియు ఇతరులలో వివరించిన విధంగా 4 వారాల వయస్సు గల మొక్కల టిసివి టీకాలు వేయడం జరిగింది. 39 . క్లుప్తంగా, సిడిఎన్ఎ క్లోన్ యొక్క విట్రో ట్రాన్స్క్రిప్ట్స్ 35 ng μl −1 యొక్క తుది సాంద్రత వద్ద ఉపయోగించబడ్డాయి; మూడు అరబిడోప్సిస్ ఆకులకు 2 μl వర్తించబడింది. TCV CP ను ఇమ్యునోబ్లోట్ విశ్లేషణలను ఉపయోగించి 1: 10, 000 యాంటీ-సిపి యాంటీబాడీని ఉపయోగించి కుందేలులో పెంచారు మరియు 1: 10, 000 సెకండరీ యాంటీ రాబిట్ యాంటీబాడీస్ (సిగ్మా-ఆల్డ్రిచ్) ఉపయోగించి లెక్కించారు. టమోటా మరియు బంగాళాదుంపల కోసం, 6 వారాల వయస్సు గల మొక్కలను టీకాలు వేయడానికి ముందు ascr # 18 లేదా నియంత్రణ ద్రావణంతో 48 గంటలు ముందే చికిత్స చేశారు. మనోసాల్వా మరియు ఇతరులలో వివరించిన విధంగా వేరు చేయబడిన-కరపత్రాల పరీక్షను ఉపయోగించి మొక్కలు ఫైటోఫ్థోరా ఇన్ఫెస్టన్స్ (యుఎస్ 22) యొక్క వైరస్ జాతితో సంక్రమించాయి. 40 . క్లుప్తంగా, అబాక్సియల్ కరపత్రం ఉపరితలం 20 μl స్ప్రాంజియా సస్పెన్షన్ (4, 000 స్ప్రాంజియా ml −1 ) ను వదలడం ద్వారా టీకాలు వేయబడింది. కరపత్రం టీకాలు వేయడానికి ముందు జూస్పోర్ విడుదల కోసం స్పోరంగియా సస్పెన్షన్ 4 ° C వద్ద 3 గం వరకు పొదిగేది. టీకాలు వేసిన కరపత్రాలను నీటి అగర్ కలిగి ఉన్న పెట్రీ వంటలలో ఉంచారు మరియు 15 ° C వద్ద పొదిగేవారు. బ్లైటెడ్ ఏరియాను 5 డిపిఐ వద్ద కొలుస్తారు మరియు స్పొరంగియా సంఖ్యలను 7 డిపిఐగా లెక్కించారు టమోటాలో పిఎస్టీ బ్యాక్టీరియా పెరుగుదల పరీక్షల కోసం, ఆస్కార్ # 18-ప్రీ-ట్రీట్డ్ మరియు మాక్-ట్రీట్డ్ ప్లాంట్లు వాక్యూమ్-చొరబడి 10-ఎమ్ఎమ్ ఎంజిసిఎల్ 2 లో వైరస్ పిఎస్టి డిసి 3000 యొక్క సస్పెన్షన్తో 1 × 10 5 cfu ml −1 సాంద్రతతో 0.02% సిల్వెట్ L-77 కలిగి ఉంటుంది. 4 l బ్యాక్టీరియా సస్పెన్షన్‌లో మొక్కలను తలక్రిందులుగా ముంచారు మరియు 1 లేదా 2 నిమిషాలు ఒక శూన్యత వర్తించబడుతుంది, తరువాత నెమ్మదిగా విడుదల చేయబడి ఆకులను ఒకేలా చొరబడటానికి. మొక్కలను గ్రోత్ చాంబర్‌లో 16-హెచ్ ప్రకాశం మరియు 60 ° తేమతో 22 ° C వద్ద పొదిగించారు. బాక్టీరియల్ లెక్కింపు 4 డిపిఐ జరిగింది

బార్లీ సివి కోసం. గోల్డెన్ ప్రామిస్, 7 రోజుల వయస్సు గల మొలకలని ascr # 18 యొక్క వివిధ సాంద్రతలను కలిగి ఉన్న సజల ద్రావణాలతో చల్లడం ద్వారా ముందే చికిత్స చేశారు. వేరుచేసిన-ఆకు పరీక్షను ఉపయోగించి Bgh తో టీకాలు వేయడం 48 hpt జరిగింది. క్లుప్తంగా, ప్రీ-ట్రీట్మెంట్కు 5 వేర్వేరు బార్లీ మొక్కల నుండి 10 ఆకులు కత్తిరించి 1% వాటర్ అగర్ కలిగిన పెట్రీ వంటకాలకు బదిలీ చేయబడ్డాయి. అప్పుడు ఆకులను Bgh తో టీకాలు వేయించారు . స్ఫోటములు 7 dpi గా లెక్కించబడ్డాయి

నెమటోడ్ ఇన్ఫెక్షన్ యొక్క అరబిడోప్సిస్ పరీక్షల కోసం, హెచ్. షాచ్టి మరియు ఎం. అజ్ఞాతంలో గతంలో వివరించిన విధంగా ప్రచారం చేయబడ్డాయి మరియు పొదిగినవి. క్లుప్తంగా, గ్రీన్హౌస్-పెరిగిన క్యాబేజీ ( బ్రాసికా ఒలేరేసియా సివి. ఆల్ సీజన్) మరియు టమోటా ( సోలనం లైకోపెర్సికం సివి. చిన్న టిమ్) పై వరుసగా హెటెరోడెరా షాచ్టి మరియు మెలోయిడోజైన్ అజ్ఞాత ప్రచారం చేయబడ్డాయి. హెచ్. షాచ్తీ గుడ్లను వేరుచేయడానికి, నెమటోడ్ తిత్తులు ఒక గాజు సజాతీయతలో మెత్తగా చూర్ణం చేయబడ్డాయి మరియు గుడ్లు సేకరించి 25-μm జల్లెడపై నీటిలో కడిగివేయబడతాయి . M. అజ్ఞాత గుడ్లు టమోటా మూలాలపై గుడ్డు ద్రవ్యరాశి నుండి 0.5% సోడియం హైపోక్లోరైట్‌తో వేరుచేయబడి 25-μm జల్లెడపై నీటితో కడిగివేయబడతాయి. సేకరించిన నెమటోడ్ గుడ్లను 0.02% సోడియం అజైడ్ ద్రావణంలో 20 నిముషాల పాటు చికిత్స చేసి, ఆపై 1.5 రోజుల మి.లీ ml -1 జెంటామైసిన్ సల్ఫేట్ మరియు 0.05 mg ml −1 నిస్టాటిన్ కలిగి ఉన్న నీటిపై 3 రోజుల పాటు బేర్మన్ పాన్ మీద గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద పొదిగినది. పొదిగిన రెండవ దశ బాల్య (జె 2) సేకరించబడింది, మెర్క్యురిక్ క్లోరైడ్ (0.004%) మరియు సోడియం అజైడ్ (0.004%) యొక్క సజల ద్రావణంతో 10 నిమిషాలు ఉపరితలం క్రిమిరహితం చేయబడి, శుభ్రమైన స్వేదనజలంతో మూడుసార్లు కడిగివేయబడుతుంది. ఉపరితల-క్రిమిరహితం చేయబడిన J2 ను 10 μl కు 10 J2 లార్వా గా concent త వద్ద 0.1% అగరోజ్‌లో తిరిగి చేర్చారు మరియు అరబిడోప్సిస్ టీకాల కోసం ఉపయోగించారు . అరబిడోప్సిస్ థాలియానా ఎకోటైప్ కల్ -0 విత్తనాలను ఉపరితల క్రిమిరహితం చేసి, ఆరు బావుల పలకలలో నాప్ మాధ్యమంతో 2% సుక్రోజ్ 42 కలిగి ఉంది . 16-h లైట్ / 8-h చీకటి పరిస్థితులలో మొక్కలను 24 ° C వద్ద పెంచారు. 10 రోజుల వయస్సు గల మొలకలను కలిగి ఉన్న ప్రతి బావికి రెండు మి.లీ.ల వివిధ సాంద్రత ascr # 18 లేదా నియంత్రణ ద్రావణాన్ని చేర్చారు. 48 గంటల ప్రీ - ట్రీట్మెంట్ తరువాత, ద్రావణం తొలగించబడింది మరియు H 200 తాజాగా పొదిగిన మరియు ఉపరితల-క్రిమిరహితం చేయబడిన హెచ్. స్కాచైటి లేదా ∼ 300 తాజాగా పొదిగిన మరియు ఉపరితల-క్రిమిరహితం చేయబడిన J2 M. అజ్ఞాత ప్రతి విత్తనాల మూలాలపై టీకాలు వేయబడ్డాయి. ప్రతి చికిత్సకు ఇరవై నాలుగు మొలకలని చేర్చారు. టీకాలు వేసిన 4 వారాల తరువాత హెచ్. షాచ్తీ కోసం నెమటోడ్ ఆడవారిని సూక్ష్మదర్శిని క్రింద లెక్కించారు. టీకాలు వేసిన 6 వారాల తర్వాత M. అజ్ఞాతానికి సంబంధించిన గాల్స్‌ను సూక్ష్మదర్శిని క్రింద లెక్కించారు.

ఆర్‌ఎన్‌ఏ విశ్లేషిస్తుంది

వేరే విధంగా చెప్పకపోతే, మూడు జీవ ప్రతిరూపాలు ప్రదర్శించబడ్డాయి. ప్రతి ప్రతిరూపానికి, అరబిడోప్సిస్ ఆకుల నుండి మొత్తం RNA మూడు మొక్కల నుండి ఒక ఆకు యొక్క కొలను నుండి వేరుచేయబడింది. టమోటా కోసం, ఒక మొక్కకు ఒక ఆకుకు ఆరు ఆకు డిస్కుల నుండి RNA వేరుచేయబడింది. తయారీదారు సూచనల మేరకు మొత్తం RNA కియాజీన్ RNeasy ప్లాంట్ మినీ కిట్ (కియాగెన్) ఉపయోగించి వేరుచేయబడింది. తయారీదారు సూచనలను అనుసరించి DNA- ఉచిత కిట్ (అంబియన్) ను ఉపయోగించి DNAse చికిత్స జరిగింది. ఫస్ట్-స్ట్రాండ్ సిడిఎన్ఎను 1 μg ఆర్‌ఎన్‌ఎ నుండి సూపర్‌స్క్రిప్ట్ II (లైఫ్ టెక్నాలజీస్) ఉపయోగించి సంశ్లేషణ చేశారు మరియు జన్యు-నిర్దిష్ట ప్రైమర్‌లను (సప్లిమెంటరీ టేబుల్ 3) ఉపయోగించి విస్తరించారు. RT-PCR యాంప్లిఫికేషన్లను సాధారణీకరించడానికి నియంత్రణ ప్రతిచర్యలు నిర్మాణాత్మకంగా వ్యక్తీకరించబడిన అరబిడోప్సిస్ β- ట్యూబులిన్ మరియు టమోటా అనువాద పొడుగు కారకం 1α ( EF1α ) జన్యువు కోసం ప్రైమర్‌లతో అమలు చేయబడ్డాయి. క్వాంటిటేటివ్ రియల్-టైమ్ పిసిఆర్ (qRT-PCR) కొరకు, ట్రాన్స్క్రిప్ట్స్ IQ SYBR గ్రీన్ సూపర్మిక్స్ (బయో-రాడ్) ను ఉపయోగించి 5 ofl నుండి 10 × -డైల్టెడ్ సిడిఎన్ఎ నుండి మొత్తం 20 μl ప్రతిచర్యలో 1 μl 10 μM జన్యు-నిర్దిష్ట ప్రైమర్‌లను ఉపయోగించి (అనుబంధ పట్టిక 3). CFX96 టచ్ బయోరాడ్ రియల్ టైమ్ పిసిఆర్ సిస్టమ్ (బయో-రాడ్) ఉపయోగించి ప్రతిచర్యలు జరిగాయి. PCR పరిస్థితులు 3 నిమిషాలకు 95 ° C (ప్రారంభ డీనాటరేషన్) తరువాత 40 చక్రాల విస్తరణ (15 సెకన్లకు 95 ° C, 60 సెకన్లకు 60 ° C), తరువాత డిస్సోసియేషన్ కర్వ్ యొక్క తరం. మూడు జీవ ప్రతిరూపాలకు మూడు సాంకేతిక ప్రతిరూపాలు జరిగాయి. అరబిడోప్సిస్ మరియు టమోటాలోని రక్షణ-ప్రతిస్పందన జన్యువుల ట్రాన్స్క్రిప్ట్ స్థాయి మాక్-చికిత్స చేసిన మొక్కలకు సంబంధించి రెట్లు మార్పుగా చూపబడింది. సాపేక్ష రెట్లు మార్పు 2 −ΔΔCt పద్ధతి 43 ప్రకారం లెక్కించబడుతుంది. ఉబిక్విటిన్ ( అరబిడోప్సిస్ ) మరియు ఆక్టిన్ (టమోటా) ఎండోజెనస్ రిఫరెన్స్ జన్యువులుగా ఉపయోగించబడ్డాయి. Ac- స్థాయి 0.05 తో జత చేసిన టి -టెస్ట్, ట్రాన్స్క్రిప్ట్ స్థాయిని ascr # 18-చికిత్సలో మరియు మాక్-చికిత్స చేసిన నమూనాలతో పోల్చడానికి ఉపయోగించబడింది.

బార్లీ విశ్లేషణల కోసం, తయారీదారు సూచనలను అనుసరించి సోకిన బార్లీ ఆకుల నుండి RNA వెలికితీత TRIzol (Invitrogen) తో నిర్వహించబడింది. క్వాంటిటెక్ రివర్స్-ట్రాన్స్క్రిప్షన్ కిట్ (కియాగెన్) ను ఉపయోగించి సిడిఎన్ఎ సంశ్లేషణ కోసం తాజాగా సేకరించిన ఎంఆర్ఎన్ఎ ఉపయోగించబడింది. cDNA −20. C వద్ద నిల్వ చేయబడింది. QRT-PCR కోసం, అప్లైడ్ బయోసిస్టమ్స్ 7500 ఫాస్ట్ రియల్-టైమ్ PCR వ్యవస్థలో 50 ng cDNA ను టెంప్లేట్‌గా ఉపయోగించారు. 7.5 μl SYBER గ్రీన్ జంప్‌స్టార్ట్ టాక్ రెడీమిక్స్ (సిగ్మా-ఆల్డ్రిచ్) లో 0.5 pmol ఒలిగోన్యూక్లియోటైడ్స్‌తో విస్తరణలు జరిగాయి. 44 వివరించిన విధంగా 2 ΔCt పద్ధతిని ఉపయోగించి బార్లీ జన్యువులకు ట్రాన్స్క్రిప్ట్ సమృద్ధి యొక్క సాపేక్ష పరిమాణీకరణ జరిగింది. బార్లీలో, ఉబిక్విటిన్ ఎండోజెనస్ రిఫరెన్స్ జన్యువుగా ఉపయోగించబడింది.

మూలాల్లోని RNA విశ్లేషణల కోసం, ప్రతి చికిత్స కోసం అరబిడోప్సిస్ మూలాలను 20-30 మొలకల నుండి సేకరించారు మరియు డైనబెడ్స్ mRNA DIRECT కిట్ (లైఫ్ టెక్నాలజీస్) ఉపయోగించి mRNA వేరుచేయబడింది. DNase I (లైఫ్ టెక్నాలజీస్) తో చికిత్స ద్వారా DNA కాలుష్యం తొలగించబడింది. ఫస్ట్-స్ట్రాండ్ సిడిఎన్ఎను ప్రోటోస్క్రిప్ట్ II రివర్స్ ట్రాన్స్క్రిప్టేజ్ (ఎన్ఇబి) ఉపయోగించి 50 ఎన్జి ఎంఆర్ఎన్ఎ నుండి సంశ్లేషణ చేశారు. QRT-PCR పరీక్షను ఐసైక్లర్ ఐక్యూ రియల్-టైమ్ పిసిఆర్ డిటెక్షన్ సిస్టమ్ (బయో-రాడ్) లో నిర్వహించారు మరియు ఐటాక్ యూనివర్సల్ ఎస్వైబిఆర్ గ్రీన్ సూపర్మిక్స్ (బయో-రాడ్) ను ఉపయోగించి ట్రాన్స్క్రిప్ట్స్ విస్తరించబడ్డాయి. ప్రతి 10 μM జన్యు-నిర్దిష్ట ప్రైమర్ (అనుబంధ పట్టిక 3) లో 1 μl ఉపయోగించి 20 μl ప్రతిచర్య. అన్ని పరీక్షలు ప్రతి RNA నమూనాకు మూడు సాంకేతిక ప్రతిరూపాలను కలిగి ఉంటాయి. ఐసైక్లర్ ఐక్యూ రియల్ టైమ్ పిసిఆర్ డిటెక్షన్ సిస్టమ్ సాఫ్ట్‌వేర్ వెర్షన్ 3.0 ఎ (బయో-రాడ్) ఉపయోగించి డేటాను విశ్లేషించారు. అరబిడోప్సిస్ UFP జన్యువు (AT4G01000) ను ఎండోజెనస్ రిఫరెన్స్ జన్యువుగా ఉపయోగించారు. పిసిఆర్ ఒక ఆక్టివేషన్ మరియు డిఎన్ఎ డీనాటరేషన్ స్టెప్ (3 నిమిషానికి 95 ° సి) తో ప్రారంభించబడింది, తరువాత 40 సెకన్లు 95 ° C 20 సెకన్లకు మరియు 40 సెకన్లకు 60 ° సి. సాపేక్ష రెట్లు మార్పు 2 −ΔΔCt పద్ధతి 43 ప్రకారం లెక్కించబడుతుంది.

అనుబంధ సమాచారం

PDF ఫైళ్లు

  1. 1.

    అనుబంధ సమాచారం

    అనుబంధ గణాంకాలు 1-9, అనుబంధ పట్టికలు 1-3, అనుబంధ పద్ధతులు మరియు అనుబంధ సూచనలు

వ్యాఖ్యలు

వ్యాఖ్యను సమర్పించడం ద్వారా మీరు మా నిబంధనలు మరియు సంఘ మార్గదర్శకాలకు కట్టుబడి ఉండాలని అంగీకరిస్తున్నారు. మీరు దుర్వినియోగమైనదాన్ని కనుగొంటే లేదా అది మా నిబంధనలు లేదా మార్గదర్శకాలకు అనుగుణంగా లేనట్లయితే దయచేసి దాన్ని అనుచితమైనదిగా ఫ్లాగ్ చేయండి.