మౌస్ ఫోర్‌బ్రేన్‌లో రొమ్ము కార్సినోమా యాంప్లిఫైడ్ సీక్వెన్స్ 2 (bcas2) యొక్క షరతులతో కూడిన నాకౌట్ β- కాటెనిన్ ద్వారా డెన్డ్రిటిక్ వైకల్యానికి కారణమవుతుంది | శాస్త్రీయ నివేదికలు

మౌస్ ఫోర్‌బ్రేన్‌లో రొమ్ము కార్సినోమా యాంప్లిఫైడ్ సీక్వెన్స్ 2 (bcas2) యొక్క షరతులతో కూడిన నాకౌట్ β- కాటెనిన్ ద్వారా డెన్డ్రిటిక్ వైకల్యానికి కారణమవుతుంది | శాస్త్రీయ నివేదికలు

Anonim

విషయము

  • హిప్పోకాంపస్
  • మాలిక్యులర్ న్యూరోసైన్స్
  • న్యూరోనల్ అభివృద్ధి

నైరూప్య

రొమ్ము కార్సినోమా యాంప్లిఫైడ్ సీక్వెన్స్ 2 (BCAS2) అనేది hPrP19 కాంప్లెక్స్ యొక్క ప్రధాన భాగం, ఇది RNA స్ప్లికింగ్‌ను నియంత్రిస్తుంది. ఇక్కడ, మేము ఎక్సాన్ అర్రే అస్సేను ప్రదర్శించాము మరియు BCAS2 స్ప్లికింగ్ రెగ్యులేషన్ యొక్క లక్ష్యం β-catenin అని చూపించాము. End- కాటెనిన్ చేత డెండ్రైట్ పెరుగుదల మరియు పదనిర్మాణం యొక్క నియంత్రణ చక్కగా నమోదు చేయబడింది. అందువల్ల, డెన్డ్రైట్ వృద్ధిలో BCAS2 పాత్రను పరిశోధించడానికి ముందరి భాగంలో BCAS2 వ్యక్తీకరణను తొలగించడానికి మేము షరతులతో కూడిన నాకౌట్ (cKO) ఎలుకలను రూపొందించాము. BCAS2 cKO ఎలుకలు మైక్రోసెఫాలీ లాంటి సమలక్షణాన్ని డెంటేట్ గైరస్ (DG) లో తక్కువ వాల్యూమ్ మరియు తక్కువ స్థాయి అభ్యాసం మరియు జ్ఞాపకశక్తిని చూపించాయి, వీటిని వరుసగా మోరిస్ వాటర్ మేజ్ విశ్లేషణ మరియు నిష్క్రియాత్మక ఎగవేత ఉపయోగించి అంచనా వేస్తారు. గొల్గి స్టెయినింగ్ BCAS2 cKO ఎలుకల DG లో తక్కువ డెన్డ్రైట్లు, తక్కువ డెన్డ్రిటిక్ సంక్లిష్టత మరియు వెన్నెముక సాంద్రత తగ్గింది. అంతేకాకుండా, సికెఓ ఎలుకలు నవజాత న్యూరాన్లలో డిసిఎక్స్ లేబుల్ చేయబడిన అపరిపక్వ న్యూరాన్ల మార్కర్ మరియు బ్రూడూ విలీనంలో చిన్న డెండ్రైట్ పొడవును ప్రదర్శించాయి. BCAS2- మధ్యవర్తిత్వ డెన్డ్రిటిక్ వైకల్యానికి అంతర్లీనంగా ఉన్న యంత్రాంగాన్ని మరింత పరిశీలించడానికి, మేము BCAS2- క్షీణించిన ప్రాధమిక న్యూరాన్లలో β- కాటెనిన్‌ను అతిగా నొక్కిచెప్పాము మరియు డెన్డ్రిటిక్ వృద్ధి పునరుద్ధరించబడిందని కనుగొన్నాము. సారాంశంలో, BCAS2 అనేది β- కాటెనిన్ జన్యు వ్యక్తీకరణ యొక్క అప్‌స్ట్రీమ్ రెగ్యులేటర్ మరియు పాక్షికంగా β- కాటెనిన్ ద్వారా డెండ్రైట్ పెరుగుదలలో పాత్ర పోషిస్తుంది.

పరిచయం

రొమ్ము కార్సినోమా యాంప్లిఫైడ్ సీక్వెన్స్ 2 (బిసిఎఎస్ 2) జన్యువును 26-కెడి చిన్న అణు ప్రోటీన్‌ను ఎన్కోడింగ్ చేసే మానవ క్రోమోజోమ్ 1 పి 13.2 ప్రాంతానికి మ్యాప్ చేస్తారు. ER జన్యు వ్యక్తీకరణ 1, 2 కు మధ్యవర్తిత్వం చేయడానికి BCAS2 ఈస్ట్రోజెన్ రిసెప్టర్ (ER) తో బంధిస్తుంది. ఆండ్రోజెన్ రిసెప్టర్ 3 తో పరస్పర చర్యల ద్వారా BCAS2 ప్రోస్టేట్ క్యాన్సర్‌లో కూడా పాల్గొంటుంది. ఇటీవలి అధ్యయనాలు క్యాన్సర్ కారకాలతో సంబంధం ఉన్న కనీసం 2 BCAS2 విధానాలను ప్రదర్శించాయి: (1) p53 యొక్క ప్రతికూల నియంత్రణ: BCAS2 యొక్క క్షీణత p53 అడవి-రకం కణ తంతువులలో అపోప్టోసిస్‌కు దారితీస్తుంది, అయితే p53 శూన్య మరియు p53 ఉత్పరివర్తన కణాలలో G2 / M పెరుగుదల అరెస్టును ప్రేరేపిస్తుంది; మరియు (2) hPrp19 కాంప్లెక్స్ 5 యొక్క DNA మరమ్మత్తు పనితీరులో పాల్గొన్న సింగిల్-స్ట్రాండ్డ్ DNA- బైండింగ్ ప్రోటీన్‌తో బంధించడం, ఇది DNA నష్టం ప్రతిస్పందన 6 లో పాల్గొంటుంది.

7, 8 RNA స్ప్లికింగ్‌ను నియంత్రించడానికి BCAS2 Prp19 స్ప్లైసోసోమ్ కాంప్లెక్స్ యొక్క ప్రధాన సభ్యుడు. BCAS2 / spf27 సబ్యూనిట్ యొక్క నాక్‌డౌన్ hPrp19 కాంప్లెక్స్‌ను అస్థిరపరుస్తుంది, దీని ఫలితంగా మైటోటిక్ లోపాలు ఏర్పడతాయి 9 . పిండం దశ 10 లో BCAS2 ఇటీవల ఒక ముఖ్యమైన జన్యువుగా కనుగొనబడింది. BCAS2 యొక్క రెక్క-నిర్దిష్ట నాక్‌డౌన్ డ్రోసోఫిలా వింగ్ అభివృద్ధి లోపాలకు కారణమవుతుందని మేము గతంలో నివేదించాము; BCAS2 కారణంగా డెల్టా ప్రీ-ఎంఆర్ఎన్ఎ స్ప్లికింగ్‌లో పాల్గొంటుంది మరియు డెల్టా-నాచ్ సిగ్నలింగ్ 12 ను నియంత్రిస్తుంది. న్యూరోజెనిసిస్‌లో డెల్టా-నాచ్ సిగ్నలింగ్ ముఖ్యమైనదని అంటారు. ఉదాహరణకు, Dlk1 లో ఎలుకల లోపం సబ్‌వెంట్రిక్యులర్ జోన్ (SVZ) లోని ప్రసవానంతర న్యూరోజెనిసిస్‌లో లోపాలను చూపుతుంది, దీని ఫలితంగా ఘ్రాణ బల్బ్ 13 లో పరిపక్వ న్యూరాన్లు లేకపోవడం జరుగుతుంది. BCAS2- లక్ష్యంగా ఉన్న జన్యువులపై అంతర్దృష్టిని పొందడానికి, మేము BCAS2- క్షీణించిన కణాలను ఉపయోగించి ఎక్సోన్ అర్రే విశ్లేషణను చేసాము. ప్రత్యామ్నాయ స్ప్లికింగ్ సంఘటనల యొక్క క్రియాత్మక జాబితా నుండి, AC-catenin BCAS2- లక్ష్య జన్యువులకు (అనుబంధ పట్టిక S1) అభ్యర్థి. న్యూరోనల్ అభివృద్ధి మరియు న్యూరోజెనిసిస్ 14, 15 లో Wnt / cat-catenin సిగ్నలింగ్ ముఖ్యమైన పాత్ర పోషిస్తుంది. - కాటెనిన్ యొక్క అంతరాయం డెన్డ్రిటిక్ మరియు మెదడు వైకల్యానికి దారితీస్తుంది, ఇది క్షీణించిన వ్యాధులకు దారితీస్తుంది 16, 17, 18 .

క్షీరదాల మెదడులోని న్యూరాన్లు సంక్లిష్టమైన డెన్డ్రిటిక్ చెట్లను కలిగి ఉంటాయి. సినాప్టిక్ కార్యకలాపాల యొక్క తీవ్రత మరియు పౌన frequency పున్యం ద్వారా సవరించబడిన సినాప్టిక్ కనెక్షన్లకు డెన్డ్రైట్స్ ముఖ్యమైనవి. అందువల్ల, న్యూరల్ సర్క్యూట్ ఏర్పడటానికి మరియు అభ్యాసం మరియు జ్ఞాపకశక్తి 19 వంటి అభిజ్ఞాత్మక ప్రక్రియల కోసం సినాప్టిక్ ఇన్పుట్ ప్రాసెసింగ్ కోసం డెన్డ్రిటిక్ అభివృద్ధి కీలకం. BCAS2 యొక్క గ్లోబల్ KO ప్రాణాంతకం 10, మరియు hPrp19 కాంప్లెక్స్ (ఉదా., PLGR1 లేదా PSO4) లోని ఒక సభ్యుడిని క్షీణించడం మౌస్ మోడల్ 20, 21 లో ప్రారంభ పిండ ప్రాణాంతకానికి దారితీస్తుందని చూపించే ప్రస్తుత నివేదికలకు అనుగుణంగా ఉంది. డెన్డ్రిటిక్ అభివృద్ధిలో BCAS2 పాత్రను అధ్యయనం చేయడానికి, మేము మా ఫ్లోక్స్డ్-బిసిఎఎస్ 2 ఎలుకలను కాల్షియం / కాల్మోడ్యులిన్-ఆధారిత ప్రోటీన్ కినేస్ IIα (CaMKIIα) తో దాటాము - ప్రసవానంతర ముందరి భాగంలో BCAS2 ను షరతులతో నాకౌట్ చేయడానికి ట్రాన్స్జెనిక్ ఎలుకలు. ముందరి భాగంలో BCAS2 యొక్క షరతులతో కూడిన నాకౌట్ (cKO) ఫలితంగా మైక్రోసెఫాలీ లాంటి మెదడు పరిమాణం ఏర్పడింది. BCAS2 cKO ఎలుకలు హిప్పోకాంపస్‌లో బలహీనమైన అభ్యాసం మరియు జ్ఞాపకశక్తి మరియు డెన్డ్రిటిక్ వైకల్యాన్ని ప్రదర్శించాయి. అదనంగా, BCAS2 యొక్క క్షీణత సెల్ లైన్లు మరియు cKO ఎలుకలలో β-catenin pre-mRNA యొక్క స్ప్లికింగ్ సామర్థ్యాన్ని తగ్గించింది. అంతేకాకుండా, ne- కాటెనిన్ యొక్క ఎక్సోజనస్ వ్యక్తీకరణ ప్రాధమిక న్యూరానల్ కణాలలో తగ్గిన డెన్డ్రిటిక్ పొడవును పునరుద్ధరించగలదు. సారాంశంలో, BCAS2 అనేది β- కాటెనిన్ జన్యు వ్యక్తీకరణ యొక్క అప్‌స్ట్రీమ్ రెగ్యులేటర్, మరియు ఇది పాక్షికంగా β- కాటెనిన్ ద్వారా డెండ్రైట్ పెరుగుదలలో పాత్ర పోషిస్తుంది.

ఫలితాలు

M-catenin యొక్క వ్యక్తీకరణ BCAS2 ద్వారా ప్రీ-ఎంఆర్ఎన్ఎ స్ప్లిసింగ్ ద్వారా నియంత్రించబడుతుంది

BCAS2 ప్రీ-ఎంఆర్ఎన్ఎ స్ప్లికింగ్ 7, 11 ను నియంత్రిస్తుంది. అభ్యర్థి BCAS2- టార్గెటెడ్ జన్యువుల కోసం శోధించడానికి, మేము ఎక్సాన్ అర్రే అనాలిసిస్ (సప్లిమెంటరీ టేబుల్ S1) చేయడానికి BCAS2- నాక్‌డౌన్ MCF7 కణాల నుండి RNA ను సేకరించాము మరియు β- కాటెనిన్ BCAS2- లక్ష్యంగా ఉన్న జన్యువు అని కనుగొన్నాము. AS-catenin splicing యొక్క సామర్థ్యాన్ని BCAS2 క్షీణత ద్వారా ప్రభావితం చేయవచ్చో లేదో నిర్ధారించడానికి, మేము β-catenin mRNA మరియు ప్రీ-mRNA యొక్క వ్యక్తీకరణను విశ్లేషించాము. ఫలితాలు β- కాటెనిన్ యొక్క mRNA స్థాయిలో గణనీయమైన తగ్గింపును చూపించాయి మరియు BCAS2- క్షీణించిన MCF7 కణాలలో (Fig. 1a, కుడి) β- కాటెనిన్ ప్రీ-mRNA చేరడం, BCAS2 లేనప్పుడు స్ప్లికింగ్ సామర్థ్యం బలహీనపడిందని సూచిస్తుంది. . అంతేకాకుండా, BCAS2- క్షీణించిన MCF7 కణాలలో β-catenin యొక్క ప్రోటీన్ వ్యక్తీకరణ తగ్గినట్లు మేము నిర్ధారించాము (Fig. 1b). ఇంతకుముందు, కాయిల్డ్-కాయిల్ మూలాంశాలను కలిగి ఉన్న BCAS2 C- టెర్మినస్ RNA స్ప్లికింగ్ కోసం అవసరం అని మేము కనుగొన్నాము. BCAS2 యొక్క పూర్తి-నిడివి లేదా సి భాగం RNA స్ప్లికింగ్ కోసం పనిచేస్తుంది, కాని డెల్టాసిసి మార్చబడిన (తొలగించబడిన కాయిల్డ్-కాయిల్ మూలాంశాలు) దాని స్ప్లికింగ్ పాత్రను 11 చేయలేవు. BCAS2 β- కాటెనిన్ స్ప్లికింగ్‌ను నియంత్రించగలదా అని మరింత ధృవీకరించడానికి, మేము పూర్తి-నిడివి BCAS2, డెల్టాసిసి మార్చబడిన లేదా సి భాగాన్ని β- కాటెనిన్-సైలెన్స్‌డ్ N2A కణాలలోకి బదిలీ చేసాము, ఆపై RT-PCR మరియు వెస్ట్రన్ బ్లాట్ ద్వారా RNA మరియు ప్రోటీన్ వ్యక్తీకరణలను కొలిచాము, వరుసగా. N2A కణాలలో అధిక β- కాటెనిన్ వ్యక్తీకరణ కారణంగా (Fig. 1c, లేన్ 1), బలవంతపు BCAS2 వ్యక్తీకరణ β-catenin RNA మరియు ప్రోటీన్ స్థాయిలను పెంచలేకపోయింది (డేటా చూపబడలేదు). అందువల్ల, AS-catenin splicing పై BCAS2 మార్పుచెందగలవారి ప్రభావాలను విశ్లేషించడానికి మేము తక్కువ cat-catenin వ్యక్తీకరణ వాతావరణాన్ని సృష్టించాల్సిన అవసరం ఉంది. 2- కాటెనిన్ RNA (Fig. 1c, లేన్ 2) మరియు ప్రోటీన్ (Fig. 1d, లేన్ 2) ను పడగొట్టడానికి మేము N2A కణాలను siβ-catenin తో చికిత్స చేసాము. సిసి-కాటెనిన్ (లేన్ 2 యొక్క లేన్ 2) తో చికిత్స చేయబడిన తక్కువ- cat- కాటెనిన్ స్థాయి N2A కణాలతో పోలిస్తే BCAS2 మరియు సి శకలం యొక్క అతిగా వ్యక్తీకరణ β- కాటెనిన్ RNA మరియు ప్రోటీన్ వ్యక్తీకరణ (Fig. 1c, d యొక్క 3 మరియు 5 లేన్లు) తో పోలిస్తే. అంజీర్ 1 సి, డి); దీనికి విరుద్ధంగా, డెల్టాసిసి ఉత్పరివర్తన ప్రభావం చూపలేదు (Fig. 1c, d యొక్క లేన్ 4). ఇంకా, నానోగ్ , β- కాటెనిన్ -టార్గెటెడ్ జన్యువు 22, 23, డెల్టాసిసి-ట్రాన్స్ఫెక్టెడ్ β- కాటెనిన్ నిశ్శబ్ద కణాలలో ఇప్పటికీ తగ్గింది, కాని BCAS2 యొక్క పూర్తి-పొడవు లేదా సి శకలం యొక్క అధిక ప్రసరణ నానోగ్ యొక్క mRNA వ్యక్తీకరణను రక్షించింది (Fig. 1e ). కలిసి చూస్తే, ఈ ఫలితాలు BCAS2 β- కాటెనిన్ RNA స్ప్లికింగ్ మరియు వ్యక్తీకరణను నియంత్రించగలదని చూపిస్తుంది.

Image

( ) MCF7 కణాలలో BCAS2 నాక్‌డౌన్ β-catenin pre-mRNA ని పెంచుతుంది మరియు β-catenin mRNA స్థాయిలను తగ్గిస్తుంది. ఎడమ: int- కాటెనిన్ (దిగువ) యొక్క ఇంట్రాన్-కలిగిన పూర్వగామి mRNA (ఎగువ) మరియు mRNA ను గుర్తించడానికి ప్రైమర్‌ల రూపకల్పన యొక్క స్కీమాటిక్ ప్రాతినిధ్యం. ప్రైమర్లు, ఎక్సోన్లు మరియు ఇంట్రాన్‌ల స్థానాలు వరుసగా బాణాల తలలు, పెట్టెలు మరియు పంక్తులతో సూచించబడతాయి. కుడి: పరిమాణాత్మక RT-PCR విశ్లేషణ (n = 3). ( బి ) BCAS2- నాక్‌డౌన్ MCF7 కణాలలో β- కాటెనిన్ ప్రోటీన్ తగ్గింది. ఎడమ, ఒక ప్రతినిధి వెస్ట్రన్ బ్లాట్. కుడి, ఎడమ పానెల్ యొక్క పరిమాణం (n = 3). ( సి, డి ) బిసిఎఎస్ 2 యొక్క పూర్తి-నిడివి బిసిఎఎస్ 2 మరియు సి-టెర్మినల్ సిఐ-కాటెనిన్-చికిత్స చేసిన ఎన్ 2 ఎ కణాలలో β- కాటెనిన్ ఆర్‌ఎన్‌ఎ ( సి ) మరియు ప్రోటీన్ ( డి ) వ్యక్తీకరణను పెంచింది, కాని డెల్టాసిసి β- కాటెనిన్ వ్యక్తీకరణను ప్రభావితం చేయలేదు. పూర్తి-నిడివి BCAS2, సి-ఫ్రాగ్మెంట్ మరియు డెల్టాసిసి మార్చబడిన ప్లాస్మిడ్‌లు β- కాటెనిన్-సైలెన్స్డ్ N2A కణాలలో విడిగా బదిలీ చేయబడ్డాయి. బదిలీ అయిన నలభై ఎనిమిది గంటల తరువాత, ఆర్‌టిఎ మరియు పిసిఆర్ మరియు పాశ్చాత్య విశ్లేషణల కోసం ఆర్‌ఎన్‌ఎ మరియు ప్రోటీన్ వరుసగా సేకరించబడ్డాయి. ఎడమ: ప్రతినిధి ఫలితం. కుడి: ఎడమ పానెల్ యొక్క పరిమాణం (n = 3). ( ) నానోగ్ వ్యక్తీకరణను చూపించే qRT-PCR (n = 3). ప్యానెల్లు a, b: P విలువను రెండు-తోక గల విద్యార్థి యొక్క t- టెస్ట్ విశ్లేషించింది. ప్యానెల్లు సి, డి మరియు ఇ: వన్-వే ANOVA. ఫలితాలు సగటుగా చూపబడతాయి ± SD అన్‌క్రాప్డ్ బ్లాట్‌లు అనుబంధ Fig. S5 లో ప్రదర్శించబడతాయి.

పూర్తి పరిమాణ చిత్రం

మెదడులో BCAS2 పంపిణీ

BCAS2 β- కాటెనిన్ స్ప్లిసింగ్‌లో పాల్గొంటుంది; అందువల్ల, BCAS2 యొక్క క్షీణత β- కాటెనిన్ జన్యు వ్యక్తీకరణలో తగ్గుతుంది (Fig. 1). న్యూరోజెనిసిస్ 14, 16, 24 లో Wnt / cat -catenin సిగ్నలింగ్ ముఖ్యమైన పాత్ర పోషిస్తుందని మునుపటి అధ్యయనాలు నిరూపించాయి. ఈ అధ్యయనంలో, ఎలుకలలో డెండ్రైట్ అభివృద్ధిలో BCAS2 పాత్రను మేము పరిశోధించాము. మొదట, వైల్డ్-టైప్ ఎలుకల (WT) వివిధ కణజాలాలలో BCAS2 పంపిణీని పరిశీలించడానికి, వెస్ట్రన్ బ్లాట్ విశ్లేషణ జరిగింది, మరియు ఫలితాలు BCAS2 కన్ను, మూత్రపిండాలు, lung పిరితిత్తులు మరియు మెదడు వంటి వివిధ కణజాలాలలో వ్యక్తీకరించబడిందని తేలింది (Fig. . ఎస్ 1 ఎ). WT ఎలుకల (Fig. S1b) యొక్క కార్టెక్స్, హిప్పోకాంపస్, థాలమస్, హైపోథాలమస్ మరియు అమిగ్డాలాతో సహా మొత్తం ముందరి భాగంలో BCAS2 వ్యక్తీకరణను IHC విశ్లేషణ వెల్లడించింది. వేర్వేరు న్యూరానల్ కణ రకాల్లో BCAS2 యొక్క వ్యక్తీకరణ నమూనాను పరిశీలించడానికి మేము వరుసగా 25, అపరిపక్వ న్యూరాన్ మరియు పరిపక్వ న్యూరాన్ గుర్తులుగా డబుల్ కార్టిన్ (DCX) మరియు న్యూయున్‌లను ఉపయోగించాము. DC (Fig. S1c) యొక్క లోపలి కణ పొరలో అపరిపక్వ న్యూరాన్ల సైటోప్లాజంలో DCX వ్యక్తీకరించబడింది మరియు BCAS2 తో సహ-వ్యక్తీకరించబడింది. DG యొక్క GCL లోని పరిపక్వ న్యూరాన్ల కేంద్రకాలలో న్యూయున్ వ్యక్తీకరించబడింది మరియు BCAS2 (Fig. S1d) తో కూడా వ్యక్తీకరించబడింది. అందువల్ల, BCAS2 ను అపరిపక్వ మరియు పరిణతి చెందిన న్యూరాన్లలో ముందరి భాగంలో వ్యక్తీకరించవచ్చు.

ఫోర్బ్రేన్-నిర్దిష్ట BCAS2 KO ఎలుకల తరం

WT ఎలుకల మెదడులో BCAS2 ఎక్కువగా వ్యక్తీకరించబడింది (Fig. S1a). BCAS2 యొక్క సర్వత్రా క్షీణత ఎలుకలలో పిండ ప్రాణాంతకానికి కారణమవుతుంది. డెన్డ్రిటిక్ అభివృద్ధిలో BCAS2 పాత్రను పరిశోధించడానికి, మేము ఫ్లోక్స్డ్-బిసిఎఎస్ 2 ఎలుకలను (బిసిఎఎస్ 2 ఫ్లోక్స్ / ఫ్లోక్స్) ఉత్పత్తి చేయడానికి క్రీ / లోక్స్పి వ్యవస్థను ఉపయోగించాము, దీనిలో బిసిఎఎస్ 2 యొక్క ఎక్సోన్లు 3 మరియు 4 లక్స్ పి చేత చుట్టుముట్టబడ్డాయి. CaMKIIα-iCre ట్రాన్స్‌జెనిక్ ఎలుకలతో ఫ్లోక్స్డ్-బిసిఎఎస్ 2 ఎలుకలను దాటడం ఫ్రేమ్‌షిఫ్ట్ మ్యుటేషన్ (Fig. 2a) తో కత్తిరించబడిన BCAS2 జన్యువును ఉత్పత్తి చేసింది. CaMKIIα-iCre ప్రసవానంతర రోజు 3 నుండి ప్రారంభమవుతుంది, గరిష్ట స్థాయి 15 26 వద్ద ఉంటుంది. RT-PCR (Fig. 2b, ఎగువ) ద్వారా సంతానం యొక్క జన్యురూపాలలో లక్ష్యంగా ఉన్న జన్యువు తొలగింపు మరియు 3 వారాల వయస్సులో క్రీ జన్యువు ఉనికిని మేము ధృవీకరించాము (Fig. 2b, తక్కువ). సంతానం జన్యురూపాల నిష్పత్తి (BCAS2 + / + : BCAS2 ఫ్లోక్స్ / + : BCAS2 ఫ్లోక్స్ / ఫ్లోక్స్) దాదాపు 1: 2: 1 (డేటా చూపబడలేదు). RT-PCR విశ్లేషణ (Fig. 2c) చూపిన విధంగా cKO ఎలుకలలో (BCAS2 ఫ్లోక్స్ / ఫ్లోక్స్; CaMKIIα-iCre + ఎలుకలు) BCAS2 mRNA వ్యక్తీకరణ బాగా తగ్గింది. వెస్ట్రన్ బ్లాట్ విశ్లేషణ కార్టెక్స్ మరియు హిప్పోకాంపస్‌లో BCAS2 ప్రోటీన్‌లో అనూహ్య తగ్గింపును చూపించింది కాని ప్లీహము, మూత్రపిండాలు లేదా సెరెబెల్లమ్‌లో కాదు (Fig. 2d). అయినప్పటికీ, CaMKIIα-iCre ట్రాన్స్‌జెనిక్ ఎలుకలలో, క్రీ రీకాంబినేస్ ప్రధానంగా న్యూరాన్‌లలో వ్యక్తీకరించబడుతుంది కాని గ్లియల్ ఫైబ్రిల్లరీ ఆమ్ల ప్రోటీన్ (GFAP) ఆస్ట్రోసైట్లు 27, 28 ; అందువల్ల, RT-PCR మరియు వెస్ట్రన్ బ్లాట్ అనాలిసిస్ (Fig. 2c, d) సూచించినట్లుగా, cKO ఎలుకల ముందరి భాగంలో ఇంకా గుర్తించదగిన BCAS2 ప్రోటీన్ వ్యక్తీకరణ ఉంది. CKO ఎలుకల DG లో BCAS2 యొక్క వ్యక్తీకరణ తగ్గిందని IFA కూడా చూపించింది, అయితే కొన్ని BCAS2 వ్యక్తీకరణ ఇప్పటికీ కనుగొనబడింది (Fig. 2e; తెలుపు బాణం). అందువల్ల, BCAS2 cKO ఎలుకల ఆస్ట్రోసైట్లలో వ్యక్తపరచబడాలి. ఈ తీర్మానాన్ని ధృవీకరించడానికి, IFA విశ్లేషణ జరిగింది, మరియు ఇది CKO (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. S2b) రెండింటి నుండి WT (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. S2a) ఎలుకలుగా GFAP- వ్యక్తీకరించే ఆస్ట్రోసైట్స్‌లో BCAS2 ఉనికిని వెల్లడించింది. కలిసి చూస్తే, మేము BCAS2 cKO ఎలుకలను విజయవంతంగా ఉత్పత్తి చేసాము మరియు ప్రత్యేకంగా న్యూరాన్‌లలో BCAS2 ను తొలగించాము కాని ముందరి భాగంలో ఆస్ట్రోసైట్లు కాదు.

Image

( ) BCAS2 జన్యు లక్ష్య వ్యూహానికి స్కీమాటిక్ ప్రాతినిధ్యం. లోక్స్పి-ఫ్లోక్స్డ్ యుగ్మ వికల్పం ఎక్సోన్స్ 2 మరియు 3 ల మధ్య చొప్పించిన ఒక లోక్స్పిని కలిగి ఉంటుంది మరియు మరొకటి లోక్స్పి ఎక్సోన్స్ 4 మరియు 5 ల మధ్య నియో క్యాసెట్ చుట్టూ రెండు ఫ్లిప్ రీకాంబినేస్ టార్గెట్స్ (ఎఫ్ఆర్టి) తో చేర్చబడుతుంది. నియో క్యాసెట్‌ను ఫ్లిప్ రీకంబినేస్ తొలగించారు. CaMKIIα-iCre పున omb సంయోగం ద్వారా ఎక్సోన్లు 3 మరియు 4 తొలగించబడ్డాయి. CU మరియు FD జన్యురూపానికి ప్రైమర్లు. ( బి ) పిసిఆర్ చేత జన్యురూపం. BCAS2 ఫ్లోక్స్ / + ; CaMKIIα-iCre + సంతానం ఒకదానితో ఒకటి దాటబడ్డాయి, దీని ఫలితంగా 6 వేర్వేరు జన్యురూపాలు వచ్చాయి. జన్యువుల DNA సంతానం తోకలు నుండి సేకరించబడింది. ఎగువ: CU మరియు FD ప్రైమర్‌లచే గుర్తించబడిన బ్యాండ్ల పరిమాణాలు BCAS2 + / + కు 0.8 kb, భిన్నమైన BCAS2- ఫ్లోక్స్డ్ యుగ్మ వికల్పం (BCAS2 ఫ్లోక్స్ / + ) కు 0.8 మరియు 0.7 kb, మరియు హోమోజైగస్ BCAS2- ఫ్లోక్స్డ్ యుగ్మ వికల్పం కోసం 0.7 kb (BCAS2 ఫ్లోక్స్ / ఫ్లోక్స్). దిగువ: క్రీ జన్యువు. ఈ అధ్యయనంలో, BCAS2 ఫ్లోక్స్ / ఫ్లోక్స్; CaMKIIα-iCre + ఎలుకలను ఫోర్బ్రేన్-నిర్దిష్ట BCAS2 cKO ఎలుకలుగా పరిగణించారు మరియు వాటికి cKO అని పేరు పెట్టారు; WT ఎలుకలు BCAS2 + / + మరియు క్రీ జన్యువును కలిగి ఉన్నాయి. ( సి ) 12 వారాల వయస్సులో WT మరియు BCAS2 cKO ఎలుకలలో BCAS2 mRNA వ్యక్తీకరణ యొక్క RT-PCR విశ్లేషణ. ఎడమ, ప్రతినిధి ఆర్‌ఎన్‌ఏ. కుడి, ఎడమ పానెల్ యొక్క పరిమాణం (n = 3). ( డి ) 12 వారాల వయస్సులో ప్రతి జన్యురూపానికి BCAS2 ప్రోటీన్ స్థాయిల యొక్క వెస్ట్రన్ బ్లాట్ విశ్లేషణ. ఎడమ, ప్రతినిధి వెస్ట్రన్ బ్లాట్. కుడి, ఎడమ పానెల్ యొక్క పరిమాణం (n = 3). ( ) 12 వారాల వయస్సు గల WT మరియు cKO ఎలుకలలో BCAS2 వ్యక్తీకరణ స్థాయిని చూపించే ఇమ్యునోఫ్లోరోసెన్స్ అస్సే (IFA). తెలుపు బాణం: cKO ఎలుకల ఆస్ట్రోసైట్స్‌లో BCAS2 వ్యక్తీకరణ. స్కేల్ బార్: 200 μm. కత్తిరించని మచ్చలు అనుబంధ Fig. S5 లో ప్రదర్శించబడతాయి.

పూర్తి పరిమాణ చిత్రం

మౌస్ ఫోర్బ్రేన్లోని BCAS2 cKO మైక్రోసెఫాలీ లాంటి సమలక్షణానికి కారణమవుతుంది

వయోజన మౌస్ ఫోర్‌బ్రేన్‌లో BCAS2 ను తొలగించే ప్రభావాన్ని మేము పరిశోధించాము. WT తో పోలిస్తే, BCAS2 cKO ఎలుకలు మెదడు పరిమాణాన్ని తగ్గించాయి (Fig. 3a, ఎడమ) కానీ సెరెబెల్లంలో కాదు, ఇది అంజీర్ 2 లోని డేటాతో అంగీకరిస్తుంది. CKO మరియు WT ల మధ్య సమాన BCAS2 వ్యక్తీకరణను చూపిస్తుంది. సికెఓ ఎలుకల ముందరి బరువు WT లిట్టర్మేట్స్ (Fig. 3a, కుడి) కంటే 20% తక్కువ, కానీ ప్రదర్శన మరియు శరీర బరువు WT తో పోల్చవచ్చు (డేటా చూపబడలేదు). ఫోర్బ్రేన్ యొక్క హిస్టాలజీ WT ఎలుకలతో పోలిస్తే సికెఓ ఎలుకలలో ఒక చిన్న ఫోర్బ్రేన్ను వెల్లడించింది (Fig. 3b). అందువల్ల, ఫోర్బ్రేన్లోని BCAS2 cKO ఫలితంగా మైక్రోసెఫాలీ లాంటి సమలక్షణం ఏర్పడింది.

Image

( ) 12 వారాల వయస్సులో మెదడు యొక్క స్వరూపం. ఎడమ: మెదడు యొక్క స్థూల దృశ్యం. తెలుపు బాణం హెడ్: ఘ్రాణ బల్బ్; నల్ల బాణం: ఫోర్బ్రేన్ భాగం; బ్లాక్ బాణం: సెరెబెల్లమ్. కుడి: ఫోర్బ్రేన్ బరువు (WT: n = 11; cKO: n = 16). ( బి ) కరోనల్ మెదడు విభాగాల నిస్ల్ మరక. స్కేల్ బార్: 1 మిమీ. ( సి ) ప్రతి 12 40-μm వైబ్రాటోమ్ విభాగం యొక్క ప్రతినిధి శ్రేణి యొక్క యాంటీ-న్యూన్ యాంటీబాడీతో IHC. స్కేల్ బార్: 500 μm. ( d ) ఇమేజ్ జె (n = 3) తో స్టీరియోలాజికల్ అనాలిసిస్ ద్వారా కొలవబడిన DG వాల్యూమ్. DG వాల్యూమ్ = (ప్రతి విభాగంలో NeuN + DG ప్రాంతాల మొత్తం) × 40 × 12. ( e ) NeuN + కణాల IHC. తెలుపు పెట్టె: సెల్ సంఖ్యను లెక్కించడానికి 25 × 25 μm 2, స్కేల్ బార్: 25 μm. ( ఎఫ్ ) డిజి ప్రాంతంలో న్యూయున్ + సెల్ సాంద్రత (ఎడమ) మరియు అంచనా వేసిన న్యూయున్ + సెల్ సంఖ్య (కుడి) యొక్క పరిమాణం. DG లోని కణిక కణ పొరల యొక్క సెల్ సాంద్రత ప్రతి జన్యురూపానికి యాదృచ్ఛికంగా ఎంచుకున్న 50 లెక్కింపు ఫ్రేమ్‌ల నుండి లెక్కించబడుతుంది (లెక్కింపు ఫ్రేమ్ ప్యానెల్ ఇలోని తెల్ల పెట్టె ద్వారా సూచించబడుతుంది) మరియు తరువాత క్యూబిక్ మిల్లీమీటర్ (న్యూయున్ + కణాలు) సెల్ సంఖ్యకు మార్చబడింది / ఫ్రేమ్ ఏరియా x సెక్షన్ మందం, n = 3) DG వాల్యూమ్ ద్వారా గుణించబడుతుంది. పరిమాణాత్మక ఫలితాలు సగటు ± SD గా చూపబడతాయి మరియు రెండు తోక గల విద్యార్థుల t- పరీక్ష ద్వారా గణాంకపరంగా విశ్లేషించబడతాయి.

పూర్తి పరిమాణ చిత్రం

CaMKIIα-iCre ట్రాన్స్‌జీన్ సెరిబ్రల్ కార్టెక్స్, అమిగ్డాలా, హిప్పోకాంపస్ (CA1, CA2, CA3 మరియు CA4 తో సహా) యొక్క ప్రొజెక్షన్ న్యూరాన్‌లలో విస్తృతంగా వ్యక్తీకరించబడినందున, డెంటేట్ గైరస్ (DG) బాగా గుర్తించబడిన హిప్పోకాంపల్ సర్క్యూట్ యొక్క క్లిష్టమైన ఎంట్రీ పాయింట్, ఇది ప్రదర్శన మార్గం నుండి CA3 న్యూరాన్లకు నాడీ సంకేతాలను తెలియజేస్తుంది, ఇది షాఫెర్ అనుషంగిక ద్వారా CA1 న్యూరాన్‌లకు మరింత ప్రాజెక్ట్ చేస్తుంది. హిప్పోకాంపల్ సర్క్యూట్ యొక్క కార్యాచరణ వివిధ అభిజ్ఞాత్మక విధులు మరియు రోగలక్షణ పరిస్థితులకు ముఖ్యమైనది, మరియు సర్క్యూట్ ప్రధాన ద్వారం, డిజి గ్రాన్యూల్ కణాలు 19 వద్ద ఉంచబడింది. హిప్పోకాంపస్ యొక్క పనితీరును అంచనా వేయడానికి, మేము మొదట మా ఉత్పరివర్తన ఎలుకలలోని DG కణిక కణాల నిర్మాణ లక్షణాలను పరిశీలించాము. DG వాల్యూమ్‌పై BCAS2 ఎలిమినేషన్ యొక్క ప్రభావాన్ని పరిశోధించడానికి, వయోజన WT మరియు cKO ఎలుకల హిప్పోకాంపస్ నుండి 40-μm వైబ్రాటోమ్ విభాగాలు న్యూన్-యాంటీబాడీ (Fig. 3c) తో తడిసినవి. అంజీర్ 3 సి ఉపయోగించి మూల్యాంకనం చేసిన డిజి వాల్యూమ్ ఇమేజ్ జె 29, 30 తో స్టీరియోలాజిక్ పద్ధతి ద్వారా లెక్కించబడుతుంది. సికెఓ ఎలుకల డిజి వాల్యూమ్ కంట్రోల్ ఎలుకల కన్నా తక్కువగా ఉంది (Fig. 3d; 0.40 vs 0.49 mm 3 ; P <0.05), ఇది అంజీర్ 3b, c లోని చిత్రాలకు అనుగుణంగా ఉంటుంది. DG లోని కణిక కణ సాంద్రతను మరింత లెక్కించడానికి, 4-μm కరోనల్ మెదడు విభాగాలు న్యూన్-యాంటీబాడీ (Fig. 3e) తో పొదిగేవి. WT ఎలుకల కన్నా బిసిఎఎస్ 2 సికెఓలో గ్రాన్యూల్ సెల్ సాంద్రత ఎక్కువగా ఉంది (Fig. 3f, ఎడమ. 2, 788, 235 vs 2, 487, 332 న్యూయున్ + కణాలు / మిమీ 3 ; పి <0.05). అదనంగా, అంచనా వేసిన కణిక సెల్ సంఖ్య cKO ఎలుకలలో కొద్దిగా తగ్గింది, కాని WT మరియు cKO ఎలుకల మధ్య DG లో ఈ సంఖ్యలో గణనీయమైన తేడా లేదు (Fig. 3f, కుడి). అందువల్ల, సికెఓ ఎలుకలలోని చిన్న డిజి వాల్యూమ్ కణాలలో ఖాళీ స్థలం వల్ల సంభవించవచ్చు.

BCAS2 cKO ఎలుకలు బలహీనమైన అభిజ్ఞా ప్రవర్తనలను చూపుతాయి

BCAS2 cKO ఎలుకలు గణనీయంగా తగ్గిన DG వాల్యూమ్ (Fig. 3) తో చిన్న మెదడులను కలిగి ఉన్నందున మరియు మునుపటి అధ్యయనాలు మెదడు పరిమాణం నేర్చుకోవడం మరియు జ్ఞాపకశక్తి సామర్థ్యాలతో 31, 32 తో సంబంధం కలిగి ఉన్నాయని నివేదించింది, మేము BCAS2 cKO ఎలుకల అభిజ్ఞా సామర్థ్యాలను విశ్లేషించాము. ఓపెన్ ఫీల్డ్ పరీక్షలో, WT మరియు cKO ఎలుకలు లోకోమోటర్ కార్యకలాపాలలో తేడా లేదు, రెండు జన్యురూపాలతో పోల్చదగిన చైతన్యం ఉంది (Fig. 4a). హిప్పోకాంపస్-ఆధారిత ప్రాదేశిక అభ్యాసం మరియు జ్ఞాపకశక్తి సామర్థ్యాలను అంచనా వేయడానికి, మోరిస్ నీటి చిట్టడవి విశ్లేషణ జరిగింది. డే 1 తో ప్రారంభమయ్యే మొత్తం 4 శిక్షణ రోజులలో, BCAS2 cKO ఎలుకలు WT కంటే ప్లాట్‌ఫారమ్‌ను కనుగొనటానికి చాలా ఎక్కువ సమయం పట్టింది. అందువల్ల, WT ఎలుకలతో పోలిస్తే, BCAS2 cKO ఎలుకలు నేర్చుకునే స్థాన సామర్థ్యాన్ని తగ్గించాయి (Fig. 4b). ప్రోబ్ ట్రయల్ కోసం, దాచిన ప్లాట్‌ఫాం తొలగించబడింది మరియు 4 రోజుల శిక్షణా ట్రయల్స్ తర్వాత మెమరీ కన్సాలిడేషన్ టార్గెట్ క్వాడ్రంట్‌లో (ప్లాట్‌ఫాం ఉంచిన చోట) ఎలుకలు గడిపిన సమయాన్ని అంచనా వేసింది. BCAS2 cKO ఎలుకలు ప్రోబ్ ట్రయల్ సమయంలో టార్గెట్ క్వాడ్రంట్లో నిలుపుదల జాప్యం గణనీయంగా తగ్గాయి, ఇది బలహీనమైన ప్రాదేశిక జ్ఞాపకశక్తిని సూచిస్తుంది (Fig. 4c). CKO అభ్యాసం మరియు జ్ఞాపకశక్తిలో బలహీనమైన పనితీరును చూపించినందున, మేము భయం జ్ఞాపకశక్తిని అంచనా వేయడానికి నిష్క్రియాత్మక ఎగవేత పరీక్షను చేసాము. ప్రతి జన్యురూపం యొక్క ఎలుకలు పోల్చదగిన భయం-సంబంధిత అభ్యాసం మరియు జ్ఞాపకశక్తి పనులకు గురయ్యాయి. ఉపకరణం ఒక కాంతి మరియు ఒక చీకటి కంపార్ట్మెంట్ నిలువు స్లైడింగ్ తలుపుతో వేరు చేయబడింది. శిక్షణ రోజున, ఎలుక చీకటి గదిలోకి ప్రవేశించి ఎలక్ట్రికల్ ఫుట్ షాక్ అందుకుంది. పరీక్ష రోజున (శిక్షణ తర్వాత 24 గంటలు), ఎలుక చీకటి కంపార్ట్మెంట్‌లోకి ప్రవేశించే సమయం నిలుపుదల జాప్యం వలె నమోదు చేయబడింది. లైట్ కంపార్ట్మెంట్లో BCAS2 cKO యొక్క జాప్యం సమయం WT (Fig. 4d) కన్నా తక్కువగా ఉంది, ఇది cKO ఎలుకలలో బలహీనమైన మెమరీ ఏకీకరణను సూచిస్తుంది. సమిష్టిగా, ప్రాదేశిక మరియు భయం జ్ఞాపకశక్తి మరియు అభ్యాస సామర్థ్యంలో BCAS2 పాత్ర ఉంది.

Image

( ) ఓపెన్ ఫీల్డ్ పరీక్షలో లోకోమోటర్ కార్యాచరణ. స్టూడెంట్స్ టి -టెస్ట్ విశ్లేషించిన ఓపెన్ ఫీల్డ్ పరీక్షలో WT ఎలుకలతో (n = 10) cKO ఎలుకలు (n = 14) తేడా చూపించలేదు. ( బి ) మోరిస్ నీటి చిట్టడవి. దాచిన ప్లాట్‌ఫారమ్‌ను కనుగొనడానికి BCAS2 cKO ఎలుకల జాప్యం WT కంటే 4 నిర్మాణాత్మక శిక్షణా రోజులు ఎక్కువ. రెండు-మార్గం ANOVA (జన్యురూపం వర్సెస్ డే) రెండు సమూహాలకు ప్రధాన జన్యురూప ప్రభావం మరియు రోజు ప్రభావాన్ని వెల్లడించింది. ( సి ) చివరి శిక్షణ రోజు తర్వాత 24 గంటల తర్వాత మోరిస్ నీటి చిట్టడవి తర్వాత ప్రోబ్ పరీక్ష. దాచిన ప్లాట్‌ఫాం తొలగించబడింది మరియు లక్ష్య క్వాడ్రంట్‌లో గడిపిన సమయాన్ని శాతాన్ని స్టూడెంట్స్ టి -టెస్ట్ (WT, n = 5; cKO, n = 6) విశ్లేషించింది. ( డి ) మెమరీ విశ్లేషణకు భయపడండి. 3 సెకన్లకు 0.1 mA యొక్క ఫుట్ షాక్‌తో జెమిని ఎగవేత వ్యవస్థను ఉపయోగించి నిష్క్రియాత్మక ఎగవేత పరీక్ష జరిగింది. పరీక్ష రోజున, లైట్ చాంబర్‌లో మౌస్ యొక్క నిలుపుదల జాప్యం రికార్డ్ చేయబడింది మరియు గరిష్ట సమయం 300 సెకన్లకు సెట్ చేయబడింది. డేటా సగటు ± SEM గా చూపబడింది, మరియు P విలువను రెండు-తోక గల విద్యార్థి యొక్క t- టెస్ట్ (WT: n = 5; cKO: n = 7) ద్వారా విశ్లేషించారు. ప్రతి జన్యురూపం యొక్క అన్ని పరీక్షించిన ఎలుకలు 12 వారాల వయస్సులో ఉన్నాయి.

పూర్తి పరిమాణ చిత్రం

ఎలుకలలో BCAS2 cKO ఫలితంగా డెన్డ్రిటిక్ వైకల్యం ఏర్పడుతుంది

మెదడు న్యూరాన్లు సంక్లిష్టమైన డెన్డ్రిటిక్ పంపిణీని ప్రదర్శిస్తాయి, ఇది న్యూరల్ సర్క్యూట్లను రూపొందించడంలో మరియు సినాప్టిక్ ఇన్పుట్లను ప్రాసెస్ చేయడంలో ప్రధాన పాత్ర పోషిస్తుంది. BCAS2 cKO ఎలుకలలో లోపభూయిష్ట హిప్పోకాంపస్-సంబంధిత అభ్యాసం మరియు జ్ఞాపకశక్తిపై మరింత అవగాహన పొందడానికి, మేము హిప్పోకాంపల్ ప్రాంతంలోని DG కణిక కణాల స్వరూపాన్ని పరిశీలించడానికి గొల్గి మరకను ఉపయోగించాము. మేము విశ్లేషణ కోసం ప్రతి జన్యురూపం యొక్క 30 కణిక కణాలను పునర్నిర్మించాము (Fig. 5a) మరియు WT ఎలుకలలో (Fig. 5b) కన్నా cKO ఎలుకలలో డెండ్రైట్ పొడవు గణనీయంగా తక్కువగా ఉందని కనుగొన్నాము. ఇంకా, మేము కణిక కణాల డెన్డ్రిటిక్ సంక్లిష్టతను కూడా పరిశీలించాము. WT ఎలుకలతో (Fig. 5c) పోలిస్తే cKO ఎలుకలలో ప్రతి డెన్డ్రిటిక్ క్రమంలో డెన్డ్రిటిక్ విభాగాల సంఖ్య గణనీయంగా తక్కువగా ఉంది. WT ఎలుకలతో (Fig. 5d) పోలిస్తే cKO ఎలుకలలో షోల్‌కు తక్కువ సంఖ్యలో ఖండనలను షోల్ విశ్లేషణ వెల్లడించింది. అంతేకాకుండా, BCAS2 cKO ఎలుకలలో, కణిక కణాల యొక్క డెన్డ్రిటిక్ వెన్నెముక సాంద్రత దూర ప్రాంతంలో గణనీయంగా తక్కువగా ఉంది, కానీ DG యొక్క సమీప ప్రాంతంలో కాదు (Fig. 5e, f). మౌస్ హిప్పోకాంపస్‌లోని BCAS2 మరియు cat-catenin మధ్య అనుబంధం, IFA cKO ఎలుకలు DG లో β- కాటెనిన్ యొక్క తక్కువ వ్యక్తీకరణను చూపించాయని వెల్లడించింది (అనుబంధ Fig. S3a, b). BCAS2 cKO ఎలుకలలో, CA1 ప్రాంతంలో β- కాటెనిన్ స్థాయి కూడా తగ్గింది (అనుబంధ Fig. S3c, d). CA1 పిరమిడల్ న్యూరాన్ల యొక్క మోర్ఫోమెట్రిక్ పారామితులను మేము లెక్కించనప్పటికీ, డెన్డ్రిటిక్ మార్కర్ అయిన మైక్రోటూబ్యూల్-అనుబంధ ప్రోటీన్ 2 యొక్క ఇమ్యునోస్టెయినింగ్ BCAS2 cKO ఎలుకలలో CA1 న్యూరాన్లలో బలహీనమైన డెన్డ్రిటిక్ నిర్మాణాలను చూపించింది (Fig. 5g). ఇది కూడా BCAS2 cKO ఎలుకల CA1 న్యూరాన్లలో β- కాటెనిన్-మెడియేటెడ్ డెన్డ్రిటిక్ వైకల్యాన్ని సూచించింది. సమిష్టిగా, BCAS2 డెన్డ్రిటిక్ వృద్ధిలో పాల్గొంటుంది.

Image

12 వారాల వయస్సులో ప్రతి జన్యురూపం యొక్క ఎలుకల నుండి గొల్గి-కలిపిన మెదడులను సేకరించి విశ్లేషించారు. ( ) హిప్పోకాంపస్ యొక్క డిజి ప్రాంతం యొక్క గొల్గి మరక. గొల్గి-స్టెయిన్డ్ డిజి గ్రాన్యూల్ న్యూరాన్ల యొక్క ఆరు ఉదాహరణలు గొల్గి చొరబాటు పద్ధతి ప్రకారం పునర్నిర్మించబడ్డాయి. స్కేల్ బార్: 50 μm. ( బి ) ప్రతి జన్యురూపం యొక్క కణిక కణాలను ఉపయోగించి డెన్డ్రిటిక్ పొడవు విశ్లేషించబడింది (WT, n = 31 కణాలు; cKO, n = 42 కణాలు). CKO ఎలుకల మొత్తం డెన్డ్రిటిక్ పొడవు గణనీయంగా తగ్గించబడింది. రెండు-తోక విద్యార్థుల టి -టెస్ట్ విశ్లేషణను ఉపయోగించి డేటా విశ్లేషించబడింది మరియు సగటు ± SEM ( సి ) డెన్డ్రిటిక్ ఆర్బర్‌కు సంక్లిష్టత డెన్డ్రిటిక్ ఆర్డర్‌కు వ్యతిరేకంగా డెన్డ్రిటిక్ విభాగాల సంఖ్యను ప్లాట్ చేయడం ద్వారా అంచనా వేయబడుతుంది. ఫలితాలు సగటుగా చూపించబడ్డాయి ± SEM P విలువను రెండు-మార్గం ANOVA (WT, n = 31 కణాలు; cKO, n = 34 కణాలు) ద్వారా విశ్లేషించారు. ( d ) షోల్ విశ్లేషణ ద్వారా నిర్ణయించబడినట్లుగా, BCAS2 cKO ఎలుకల డెన్డ్రిటిక్ సంక్లిష్టత WT కంటే తక్కువగా ఉంది. డెండ్రైట్‌లు మరియు కేంద్రీకృత వలయాల మధ్య ఖండనల సంఖ్య సోమ నుండి దూరానికి వ్యతిరేకంగా రూపొందించబడింది. రెండు-సమూహాల (WT, n = 31 కణాలు; cKO, n = 34 కణాలు) జన్యురూప ప్రభావం మరియు దూర ప్రభావానికి రెండు-మార్గం ANOVA గణనీయమైన వ్యత్యాసాన్ని వెల్లడించింది. ( ) గొల్గి-స్టెయిన్డ్ డిజి గ్రాన్యూల్ కణాలలో ప్రాక్సిమల్ (సోమా నుండి 100 μm) ప్రాంతాల డెన్డ్రిటిక్ స్పైన్స్. ( ఎఫ్ ) ప్యానెల్ యొక్క పరిమాణం ఇ. సామీప్య ప్రాంతం: 31 కణాల నుండి WT, n = 52 విభాగాలు; cKO, 34 కణాల నుండి n = 64 విభాగాలు. దూర ప్రాంతం: 31 కణాల నుండి WT, n = 63 విభాగాలు; cKO, 34 కణాల నుండి n = 86 విభాగాలు. ఫలితాలు సగటు ± SEM గా చూపించబడతాయి మరియు రెండు తోక గల విద్యార్థుల t -test ద్వారా విశ్లేషించబడతాయి. ( g ) MAP-2 యాంటీబాడీ యొక్క IFA (డెన్డ్రిటిక్ మార్కర్). స్కేల్ బార్: 100 μm. కుడి: ఎడమ పానెల్ యొక్క పరిమాణం (n = 3). ప్రతి సమూహానికి కనీసం 5 స్వతంత్ర ప్రయోగాలతో ప్యానెల్లు బి, సి, డి మరియు ఎఫ్ కొలుస్తారు.

పూర్తి పరిమాణ చిత్రం

BCAS2 cKO ఎలుకలు వయోజన DG యొక్క నవజాత న్యూరాన్లలో డెండ్రైట్ పెరుగుదలను తగ్గించాయి

DCX ఒక అపరిపక్వ న్యూరాన్ మార్కర్, మరియు న్యూక్లియస్ BCAS2 సాధారణ ఎలుకలలోని ఒక కణంలో సైటోస్కెలిటన్ DCX తో కలిసి వ్యక్తీకరించబడింది (అనుబంధ Fig. S1c). క్రీ-ఎక్స్‌ప్రెస్సింగ్ WT మరియు cKO ఎలుకలలో DG నవజాత న్యూరాన్ యొక్క డెన్డ్రిటిక్ అభివృద్ధి మరియు పెరుగుదలను BCAS2 నియంత్రించగలదా అని మేము ఆలోచిస్తున్నాము. మొదట, యాంటీ-క్రీ యాంటీబాడీ యొక్క విశిష్టతను పరీక్షించడానికి, IFA ఉపయోగించబడింది మరియు CaMKIIα-iCre ట్రాన్స్జెనిక్ ఎలుకలు (WT) యొక్క కేంద్రకంలో క్రీ వ్యక్తీకరణను చూపించింది; ఏదేమైనా, క్రీ జన్యువు లేని ట్రాన్స్జెనిక్ కాని ఎలుకలలో క్రీ గుర్తించబడలేదు (Fig. 6a). తరువాత మేము క్రీ (కామ్‌కిఐఐ-నడిచే) అపరిపక్వ న్యూరాన్‌లలో వ్యక్తీకరించబడతామా అని పరిశీలించాము. Fig. 6b (ఎగువ) లో చూపినట్లుగా, CaMKIIα-iCre ట్రాన్స్‌జెనిక్ ఎలుకల యొక్క అపరిపక్వ న్యూరాన్లలో DCX మరియు Cre కలిసి వ్యక్తీకరించబడ్డాయి మరియు క్రీ వ్యక్తీకరణ న్యూరాన్‌ల నిష్పత్తి మొత్తం DCX- పాజిటివ్ న్యూరాన్‌లలో 20% ఉంది. అరుదు-కార్వాల్హో మరియు ఇతరుల నివేదిక. 33 . ప్రతి జన్యురూపానికి 40 μm విభాగాలను ఉపయోగించి DCX + Cre + యొక్క డెండ్రైట్ పదనిర్మాణాన్ని పోల్చడానికి మేము IFA విశ్లేషణను ఉపయోగించాము. DCX + Cre + న్యూరాన్ల యొక్క డెండ్రైట్ పదనిర్మాణాన్ని వర్గీకరించడానికి, గ్రాన్యూల్ సెల్ పొర యొక్క గత సగం విస్తరించలేని చిన్న డెన్డ్రైట్ కలిగిన న్యూరాన్లు దశ A గా పరిగణించబడ్డాయి మరియు పొడవైన డెండ్రైట్ పదనిర్మాణ శాస్త్రాన్ని కలిగి ఉన్న న్యూరాన్లు (డెన్డ్రైట్లు కణిక కణంలో సగం వరకు విస్తరించబడ్డాయి పొర) దశ B 16 గా పరిగణించబడింది. CKO ఎలుకల DG లోని DCX + Cre + అపరిపక్వ న్యూరాన్లు WT ఎలుకలతో పోలిస్తే పేలవమైన డెండ్రైట్ అభివృద్ధిని కలిగి ఉన్నాయి (Fig. 6b). WT ఎలుకలలో, 30.6% DCX + Cre + న్యూరాన్లు దశ A లో ఉన్నాయని, 69.4% దశ B లో ఉన్నాయని పరిమాణ విశ్లేషణ వెల్లడించింది. CKO ఎలుకలలో, 44.2% DCX + Cre + న్యూరాన్లు A దశలో ఉన్నాయి మరియు 55.8% దశ B లో (Fig. 6 సి). అంతేకాకుండా, నవజాత న్యూరాన్ల యొక్క డెన్డ్రిటిక్ పెరుగుదలలో BCAS2 యొక్క పాత్రను మరింత పరిశీలించడానికి, BrdU నిర్వహించబడుతుంది మరియు గతంలో 16 (Fig. 6d, ఎగువ ప్యానెల్) వివరించిన విధంగా 28 రోజుల తరువాత IFA నిర్వహించబడింది. DCX + Cre + కణాలతో BrdU యొక్క సహ-వ్యక్తీకరణ కనుగొనబడింది (Fig. 6d). WT ఎలుకలలో, 32.5% మరియు 67.5% BrdU + DCX + Cre + కణాలు వరుసగా దశ A మరియు B కి చెందినవి; cKO ఎలుకలలో (Fig. 6e) వరుసగా 46.3% మరియు 53.7% తో పోలిస్తే. మొత్తంగా, ఫలితాలు BCAS2 cKO ఎలుకల అపరిపక్వ న్యూరాన్లలో బలహీనమైన డెన్డ్రిటిక్ వృద్ధిని చూపించాయి.

Image

( ) క్రీ వ్యక్తీకరణ యొక్క IFA విశ్లేషణ. CaMKIIα-iCre ట్రాన్స్‌జెనిక్ ఎలుకలు (ఎగువ) మరియు క్రీ జన్యువు (తక్కువ) లేని ట్రాన్స్‌జెనిక్ కాని ఎలుకల DG నుండి 40 μm విభాగాలు యాంటీ-క్రీ యాంటీబాడీతో పరిశీలించబడ్డాయి. స్కేల్ బార్: 200 μm. ( బి ) cKO ఎలుకలు అపరిపక్వ న్యూరాన్లలో పేలవమైన డెండ్రైట్ అభివృద్ధిని చూపుతాయి. 40 μm వైబ్రాటోమ్ విభాగాలు 6 వారాల వయస్సులో ప్రతి జన్యురూపానికి యాంటీ-డిసిఎక్స్ యాంటీబాడీ మరియు యాంటీ-క్రీ యాంటీబాడీస్‌తో రోగనిరోధక శక్తిని కలిగి ఉన్నాయి మరియు DAPI (నీలం) తో ప్రతి-తడిసినవి. తెలుపు బాణం: WT ఎలుకలలో ఎక్కువ ప్రాధమిక డెండ్రైట్‌లతో DCX + Cre + అపరిపక్వ న్యూరాన్లు. తెలుపు బాణం: DCX + Cre - అపరిపక్వ న్యూరాన్లు. చుక్కల రేఖ: రేణువు కణ పొర (జిఎల్) మధ్యలో గుర్తించే పంక్తి. స్కేల్ బార్లు, క్రీ, డిసిఎక్స్, డిఎపిఐ మరియు విలీన ప్యానెల్‌లలో 200 μm; మరియు విస్తరించిన ప్యానెల్‌లో 20 μm. ( సి ) ప్రతి జన్యురూపం యొక్క 3 ఎలుకల నుండి 300 డిసిఎక్స్ + క్రీ + కణాలకు ప్రతి దశ శాతం లెక్కించడం. దశ A: నవజాత న్యూరాన్ల అక్షం GL కి సమాంతరంగా లేదా చిన్న ప్రక్రియలతో GL కు లంబంగా ఉంటుంది. ప్రక్రియ యొక్క పొడవు చుక్కల రేఖ ద్వారా సూచించబడిన GL లో సగం కంటే తక్కువగా ఉండాలి. దశ B: దశ A. లోని న్యూరాన్ల కంటే ఎక్కువ ప్రక్రియలతో నవజాత న్యూరాన్లు. విస్తరించిన ప్రక్రియ GL మధ్యలో దాటి పరమాణు పొరను చేరుకోవాలి. ( డి ) సికెఓ ఎలుకలు నవజాత న్యూరాన్లలో పేలవమైన డెండ్రైట్ అభివృద్ధిని చూపుతాయి. ప్రతి జన్యురూపం యొక్క ఆరు వారాల వయసున్న ఎలుకలను ఐదు రోజుల పాటు BrdU తో ఇంజెక్ట్ చేసి, నవజాత న్యూరాన్ల యొక్క IFA విశ్లేషణను ఉపయోగించి DCX వ్యతిరేక, యాంటీ-క్రీ, యాంటీ- BrdU మరియు 28 వ రోజు DAPI (నీలం) తో ప్రతిఘటించారు. ఎగువ). కాన్ఫోకల్ మైక్రోస్కోపీ (దిగువ) ద్వారా DCX + Cre + BrdU + ట్రిపుల్ పాజిటివ్ కణాల ప్రతినిధి చిత్రాలు. చుక్కల పంక్తి: GL మధ్యలో గుర్తించే పంక్తి. తెలుపు బాణం: DCX + Cre + BrdU + . స్కేల్ బార్లు, క్రీ, డిసిఎక్స్, డిఎపిఐ మరియు విలీన ప్యానెల్‌లలో 200 μm; మరియు విస్తరించిన ప్యానెల్‌లో 20 μm. ( ) 50 DCX + Cre + BrdU + కణాలకు ప్రతి దశ శాతం లెక్కించడం. డేటా సగటు ± SD గా చూపబడుతుంది మరియు రెండు తోక గల విద్యార్థి యొక్క t- టెస్ట్ ద్వారా విశ్లేషించబడుతుంది.

పూర్తి పరిమాణ చిత్రం

BCAS2 cKO ఎలుకలలో β-catenin యొక్క వ్యక్తీకరణ తగ్గుతుంది

అంజీర్ 1 లో చూపినట్లుగా, BCAS2 ప్రీ-ఎంఆర్ఎన్ఎ స్ప్లిసింగ్ ద్వారా β- కాటెనిన్ జన్యు వ్యక్తీకరణను నియంత్రించింది. BCAS2 cKO ఎలుకల అసాధారణ అభిజ్ఞా ప్రవర్తనలు మరియు డెన్డ్రిటిక్ అభివృద్ధి యొక్క అంతర్లీన యంత్రాంగాన్ని మరింత పరిశోధించడానికి; CGO ఎలుకలు DG లో β- కాటెనిన్ యొక్క తక్కువ వ్యక్తీకరణను చూపించాయని IFA వెల్లడించింది (అనుబంధ Fig. S3a, b). CKO ఎలుకలలో BCAS2 చేత β- కాటెనిన్ యొక్క స్ప్లికింగ్ సామర్థ్యాన్ని మేము పరిశీలించాము, ప్రతి జన్యురూపం యొక్క హిప్పోకాంపల్ కణజాలాల నుండి RNA లు విశ్లేషించబడ్డాయి. ఫలితాలు WT (Fig. 7a) తో పోలిస్తే ప్రీ-ఆర్‌ఎన్‌ఏ చేరడం మరియు బిసిఎఎస్ 2 సికెఓ ఎలుకలలో తగ్గిన ఎంఆర్‌ఎన్ఎ స్థాయిని చూపించాయి. అంతేకాకుండా, RT-PCR మరియు వెస్ట్రన్ బ్లాట్ విశ్లేషణ WT (Fig. 7b, c) తో పోలిస్తే BCAS2 cKO ఎలుకల ముందరి భాగంలో β- కాటెనిన్ వ్యక్తీకరణ స్థాయి తగ్గినట్లు మరింత ధృవీకరించింది. అందువల్ల, BCAS2 ఫోర్బ్రేన్లో β- కాటెనిన్ ప్రీ-ఎంఆర్ఎన్ఎ స్ప్లికింగ్ను నియంత్రిస్తుంది, ఇది అంజీర్ 1 లో చూపిన డేటాకు అనుగుణంగా ఉంటుంది.

Image

( ) WT మరియు BCAS2 cKO ఎలుకల హిప్పోకాంపస్ నుండి RNA సేకరించబడింది. క్వాంటిటేటివ్ RT-PCR విశ్లేషణ BCAS2 యొక్క నష్టం పెరిగిన β- కాటెనిన్ ప్రీ-ఎంఆర్ఎన్ఎ మరియు మూడు స్వతంత్ర ప్రయోగాల ద్వారా అంచనా వేయబడిన β- కాటెనిన్ ఎంఆర్ఎన్ఎ స్థాయిలను తగ్గించిందని చూపించింది, ఇది β- కాటెనిన్ ప్రీ-ఎంఆర్ఎన్ఎ (ఎన్ = 3) యొక్క బలహీనమైన స్ప్లికింగ్ సామర్థ్యాన్ని సూచిస్తుంది. . ( బి ) β-catenin వ్యక్తీకరణ స్థాయి యొక్క RT-PCR విశ్లేషణ. ఎడమ, ప్రతినిధి ఫలితం. కుడి, ఎడమ పానెల్ యొక్క పరిమాణం (n = 3). ( సి ) ప్రతి జన్యురూపం యొక్క కార్టెక్స్ మరియు హిప్పోకాంపస్‌లో BCAS2 మరియు β- కాటెనిన్ యొక్క ప్రోటీన్ స్థాయిల యొక్క వెస్ట్రన్ బ్లాట్ విశ్లేషణ. ఎడమ, ప్రతినిధి వెస్ట్రన్ బ్లాట్. కుడి, ఎడమ పానెల్ యొక్క పరిమాణం (n = 3). ఫలితాలు సగటు ± SD గా చూపబడతాయి మరియు రెండు తోక గల విద్యార్థుల పరీక్ష ద్వారా విశ్లేషించబడతాయి. కత్తిరించని మచ్చలు అనుబంధ Fig. S5 లో ప్రదర్శించబడతాయి.

పూర్తి పరిమాణ చిత్రం

ఇంకా, డ్రోటా ప్రీ-ఎంఆర్ఎన్ఎ స్ప్లికింగ్ 12 లో డ్రోసోఫిలా బిసిఎఎస్ 2 పాల్గొంటుందని మేము గతంలో నివేదించాము. అందువల్ల, BCAS2 తొలగింపు ఫలితంగా క్షీరద కణాలలో డెల్టా ప్రీ-ఎంఆర్ఎన్ఎ యొక్క స్ప్లికింగ్ సామర్థ్యం బలహీనపడిందా అని కూడా మేము పరిశీలించాము. మా మునుపటి నివేదిక 12 తో ఒప్పందంతో డెల్టా జన్యు స్ప్లికింగ్ వాస్తవానికి BCAS2 (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. S4a) చే నియంత్రించబడిందని MCF7 కణాలలో స్ప్లికింగ్ అస్సే వెల్లడించింది. అయినప్పటికీ, cKO ఎలుకల హిప్పోకాంపల్ కణజాలాలలో, డెల్టా mRNA మరియు ప్రోటీన్ వ్యక్తీకరణ WT మరియు cKO ఎలుకల మధ్య తేడా లేదు (అనుబంధ Fig. S4b, c). అందువల్ల, డెల్టా యొక్క వ్యక్తీకరణ ఎలుకల హిప్పోకాంపస్‌లో BCAS2 చే నియంత్రించబడదు మరియు BCAS2- నియంత్రిత డెన్డ్రిటిక్ అభివృద్ధి డెల్టా-నాచ్ సిగ్నలింగ్ నుండి స్వతంత్రంగా ఉంటుంది. మొత్తంగా, ఫలితాలు BCAS2 β- కాటెనిన్ ద్వారా డెండ్రైట్ నిర్మాణం మరియు పెరుగుదలను నియంత్రిస్తుందని సూచిస్తున్నాయి.

AS-catenin యొక్క అధిక ప్రసరణ BCAS2- నాక్‌డౌన్ ప్రాధమిక న్యూరాన్‌లలో డెన్డ్రిటిక్ పెరుగుదలను కాపాడుతుంది

డెన్డ్రిటిక్ స్పైన్స్ న్యూరోనల్ డెండ్రైట్‌ల నుండి వచ్చే చిన్న ఆక్టిన్-రిచ్ ప్రోట్రూషన్స్, ఇవి అభ్యాసం మరియు జ్ఞాపకశక్తితో సంబంధం ఉన్న చాలా ఉత్తేజకరమైన సినాప్సెస్ యొక్క పోస్ట్‌నాప్టిక్ ఇన్ఫర్మేషన్ ప్రాసెసింగ్‌కు దోహదం చేస్తాయి. BCAS2 cKO ఎలుకలు అసాధారణమైన అభిజ్ఞా ప్రవర్తన, డెన్డ్రిటిక్ వైకల్యం మరియు ముందరి భాగంలో తక్కువ స్థాయి β- కాటెనిన్ వ్యక్తీకరణను చూపించాయి. ఇక్కడ, వివోలో β- కాటెనిన్ ద్వారా బిసిఎఎస్ 2 డెండ్రైట్ వృద్ధిని నియంత్రిస్తుందని మరింత ధృవీకరించడానికి, మేము బిసిఎఎస్ 2-నాక్‌డౌన్ ప్రాధమిక న్యూరాన్‌లలో β- కాటెనిన్ వ్యక్తీకరణను ప్రేరేపించాము. మౌస్ BCAS2 జన్యువును లక్ష్యంగా చేసుకున్న shBCAS2 (shmB2 # 1) అప్పుడు ఉత్పత్తి చేయబడింది, మరియు ఇది N2A కణాలలో ఎక్సోజనస్ BCAS2 వ్యక్తీకరణను సమర్థవంతంగా తగ్గించగలదు, దీనిలో ఫ్లాగ్- BCAS2 (wt) (Fig. 8aa, దారులు 4 మరియు 5) ఉన్నాయి. ShmB2 # 1 యొక్క విశిష్టతను మరింత పరీక్షించడానికి, మేము shmB2 # 1 కు నిరోధక నిశ్శబ్ద ఉత్పరివర్తన కోసం BCAS2 ఉత్పరివర్తన ప్లాస్మిడ్‌ను రూపొందించాము; shmB2 # 1-లక్ష్యంగా ఉన్న న్యూక్లియోటైడ్ సీక్వెన్స్ (స్థానం 277-293) కు అనుగుణమైన సీక్వెన్స్ మరియు దీనికి ఫ్లాగ్- BCAS2 (mt) అని పేరు పెట్టారు. ఫ్లాగ్- BCAS2 (mt) మరియు shmB2 # 1 N2A కణాలలోకి బదిలీ చేయబడినప్పుడు, ఫలితాలు ఫ్లాగ్- BCAS2 (mt) BCAS2 ప్రోటీన్‌ను ఫ్లాగ్- BCAS2 (wt) గా వ్యక్తీకరించగలవని తేలింది (Fig. 8aa, దారులు 2 మరియు 4) మరియు shmB2 # 1 ఫ్లాగ్- BCAS2 (mt) కలిగి ఉన్న కణాలలో (Fig. 8aa, లేన్ 3) ఎక్సోజనస్ BCAS2 వ్యక్తీకరణను తగ్గించలేకపోయింది. పరిమాణ విశ్లేషణ Fig. 8ab లో చూపబడింది. అదనంగా, BCAS2 నిశ్శబ్ద ఉత్పరివర్తన BCAS2- నాక్‌డౌన్ ప్రాధమిక న్యూరాన్‌లలో తగ్గిన డెన్డ్రైట్ పొడవును E18.5 పిండాల (Fig. 8ac, ప్రకటన) యొక్క ముందరి నుండి వేరుచేయబడుతుంది. సమిష్టిగా, shBCAS2 ప్రత్యేకంగా BCAS2 వ్యక్తీకరణను నిరోధించగలదు. AS-catenin BCAS2- నాక్‌డౌన్ ప్రాధమిక న్యూరాన్‌లలో డెన్డ్రిటిక్ వృద్ధిని రక్షించగలదా అని పరీక్షించడానికి, మేము న్యూరాన్‌లను మెరుగైన గ్రీన్ ఫ్లోరోసెంట్ ప్రోటీన్ (EGFP) తో బదిలీ చేసాము - shBCAS2 ప్లాస్మిడ్‌ను ఒంటరిగా లేదా ఎక్సోజనస్ V5- ట్యాగ్ చేసిన cat- కాటెనిన్ ప్లాస్మిడ్‌లతో. న్యూరాన్‌లో అతివ్యాప్తి చెందుతున్న GFP మరియు V5 వ్యక్తీకరణతో పాటు MAP2 ఉనికిని ఉపయోగించి మేము డెన్డ్రైట్ పొడవును కొలిచాము. Fig. 8b లో చూపినట్లుగా మరియు Fig. 8c లోని పరిమాణాత్మక విశ్లేషణతో, β- కాటెనిన్ యొక్క అధిక ప్రసరణ మాత్రమే నియంత్రణతో పోలిస్తే డెండ్రైట్ వృద్ధిని గణనీయంగా పెంచింది (Fig. 8b, ప్యానెల్ bb; Fig. 8c, లేన్ 2). BCAS2 నాక్‌డౌన్ కోసం, తగ్గిన డెండ్రైట్ పెరుగుదల గమనించబడింది (Fig. 8b ప్యానెల్లు bc మరియు ఉండండి; Fig. 8c, దారులు 3 మరియు 5). అయినప్పటికీ, BCAS2- నాక్‌డౌన్ కణాలలో బలవంతంగా β- కాటెనిన్ వ్యక్తీకరణ తగ్గిన డెండ్రైట్ వృద్ధిని పునరుద్ధరించింది (Fig. 8b ప్యానెల్లు bd మరియు bf; Fig. 8c, దారులు 4 మరియు 6). సమిష్టిగా, BCAS2- నాక్‌డౌన్ ప్రాధమిక న్యూరాన్‌లలో de- కాటెనిన్ డెండ్రైట్ పొడవును పునరుద్ధరించగలదని ఫలితాలు సూచిస్తున్నాయి. అంతేకాకుండా, BCAS2 ను లక్ష్యంగా చేసుకున్న ప్రతి shRNA BCAS2 స్థాయిని తగ్గించింది మరియు అంజీర్ 7c తో ఒప్పందంతో ఎండోజెనస్ cat- కాటెనిన్ స్థాయిని (Fig. 8d, లేన్లు 2 మరియు 3) తగ్గించింది. BCAS2 నాక్‌డౌన్ కణాలలో ఎక్సోజనస్ V5- ట్యాగ్ చేయబడిన β- కాటెనిన్ గుర్తించబడింది మరియు తగ్గిన β- కాటెనిన్ వ్యక్తీకరణను పునరుద్ధరించింది (Fig. 8d, దారులు 4–6). సారాంశంలో, BCAS2 న్యూరాన్ పెరుగుదలను β-catenin- ఆధారిత పద్ధతిలో నియంత్రిస్తుంది.

Image

( ) మౌస్ BCAS2 జన్యువును లక్ష్యంగా చేసుకోవడానికి shBCAS2 యొక్క గుర్తింపు. (aa) వెస్ట్రన్ బ్లాట్ విశ్లేషణ. బిసిఎఎస్ 2 సైలెంట్ మ్యూటాంట్ (ఫ్లాగ్-బిసిఎఎస్ 2 (ఎమ్‌టి)) తో కలిసి బదిలీ చేయబడినప్పుడు shmB2 # 1 ఎక్సోజనస్ బిసిఎఎస్ 2 వ్యక్తీకరణను తగ్గించలేదు. (ab) వన్-వే ANOVA చే విశ్లేషించబడిన మూడు స్వతంత్ర ప్రయోగాల పరిమాణం. (ac) BCAS2 సైలెంట్ మ్యూటాంట్ shRNA చికిత్స చేసిన ప్రాధమిక న్యూరాన్ కణాలలో డెండ్రైట్ పొడవును రక్షించగలదు. E18.5 పిండాల ముందరి నుండి వేరుచేయబడిన ప్రాధమిక న్యూరాన్లు విత్తనమయ్యాయి మరియు తరువాత కింది వాటితో బదిలీ చేయబడ్డాయి: pLL3.7 (మాక్), BCAS2 (shmB2 # 1) ను లక్ష్యంగా చేసుకున్న shRNA లు లేదా ఫ్లాగ్-ట్యాగ్ చేయబడిన BCAS2 (mt) ఒంటరిగా లేదా shBCAS2 ప్లాస్మిడ్ ఫ్లాగ్-ట్యాగ్ చేయబడిన BCAS2 (mt) తో. యాంటీ-మాప్ -2 మరియు యాంటీ-ఫ్లాగ్ యాంటీబాడీస్ ఉపయోగించి ప్లాస్మిడ్ బదిలీ అయిన 5 రోజుల తరువాత IFA జరిగింది. విలీనం చేసిన 30 EGFP / MAP-2 డబుల్ పాజిటివ్ (ac, ఎడమ ప్యానెల్లు) మరియు EGFP / MAP-2 / ఫ్లాగ్ ట్రిపుల్ పాజిటివ్ కణాలు (ac, కుడి) నుండి డెన్డ్రిటిక్ పొడవును కొలుస్తారు. (ప్రకటన) డెండ్రైట్ పొడవు యొక్క పరిమాణం. ( బి ) Cat-Catenin BCAS2- క్షీణించిన ప్రాధమిక న్యూరాన్ల యొక్క డెన్డ్రైట్ పొడవును పునరుద్ధరించగలదు. స్కేల్ బార్: 20 μm. ప్రాధమిక న్యూరాన్లు కింది వాటితో బదిలీ చేయబడ్డాయి: pLL3.7 వెన్నెముక EGFP- కలిగిన వెక్టర్ (మాక్) (ప్యానెల్ బా), BCAS2 ను లక్ష్యంగా చేసుకున్న shRNA లు (shmB2 # 1 లేదా shmB2 # 2) (ప్యానెల్లు bc మరియు ఉండండి) లేదా V5- ట్యాగ్ చేయబడిన β- కాటెనిన్ ఒంటరిగా (ప్యానెల్ బిబి), లేదా ఎక్సోజనస్ V5- టాగ్డ్ β- కాటెనిన్ ప్లాస్మిడ్‌లతో (ప్యానెల్లు బిడి, మరియు బిఎఫ్) shBCAS2 ప్లాస్మిడ్‌లు. యాంటీ-మాప్ -2, యాంటీ-వి 5 యాంటీబాడీస్ (ఎక్సోజనస్ β- కాటెనిన్ ను సూచిస్తుంది) ఉపయోగించి ప్లాస్మిడ్ బదిలీ చేసిన 5 రోజుల తరువాత IFA జరిగింది. విలీనం చేసిన 50 EGFP / MAP-2 డబుల్ పాజిటివ్ (ప్యానెల్లు ba, bc, మరియు ఉండండి) మరియు EGFP / MAP-2 / V5 ట్రిపుల్ పాజిటివ్ కణాలు (ప్యానెల్లు bb, bd మరియు bf) నుండి డెన్డ్రిటిక్ పొడవును కొలుస్తారు. ( సి ) ప్రతి సమూహం యొక్క 50 EGFP- పాజిటివ్ న్యూరైట్ల నుండి కొలుస్తారు డెండ్రైట్ పొడవు యొక్క పరిమాణం. పి విలువను వన్-వే ANOVA విశ్లేషించింది. డేటా సగటు ± SEM ( d ) N2A కణాలలో BCAS2, V5 (ఎక్సోజనస్ β- కాటెనిన్) లేదా β- కాటెనిన్ (ఎండోజెనస్) యొక్క వెస్ట్రన్ బ్లాట్ విశ్లేషణ ప్యానెల్ b లో వివరించిన ప్లాస్మిడ్‌లతో అస్థిరంగా బదిలీ చేయబడుతుంది. ఎడమ: ప్రతినిధి వెస్ట్రన్ బ్లాట్. కుడి: పరిమాణ విశ్లేషణ. ఫలితాలు సగటు ± SD గా చూపబడతాయి మరియు వన్-వే ANOVA (n = 3) ద్వారా విశ్లేషించబడతాయి. కత్తిరించని మచ్చలు అనుబంధ Fig. S5 లో ప్రదర్శించబడతాయి.

పూర్తి పరిమాణ చిత్రం

చర్చా

ఇక్కడ, BCAS2 β- కాటెనిన్ ప్రీ-ఆర్‌ఎన్‌ఏ స్ప్లికింగ్‌ను నియంత్రిస్తుందని మేము ప్రదర్శించాము. Ex-catenin BCAS2 స్ప్లికింగ్-టార్గెట్ జన్యువు (సప్లిమెంటరీ టేబుల్ S1) యొక్క అభ్యర్థి అని ఎక్సోన్ అర్రే అస్సే సూచించింది. BCAS2 లేకపోవడం β-catenin ప్రీ-mRNA స్ప్లికింగ్‌ను తగ్గించిందని మేము నిర్ధారించాము, ఇది BCAS2 cKO ఎలుకల హిప్పోకాంపల్ కణజాలాలలో β- కాటెనిన్ వ్యక్తీకరణను తగ్గించటానికి దారితీసింది (Fig. 7). అందువల్ల, BCAS2 అనేది β- కాటెనిన్ జన్యు వ్యక్తీకరణ యొక్క అప్‌స్ట్రీమ్ రెగ్యులేటర్. - కాటెనిన్ లేకపోవడం ప్రారంభ పిండ మరణానికి దారితీస్తుంది. brain- కాటెనిన్ మొత్తం మెదడులో, ముఖ్యంగా కార్టెక్స్ మరియు హిప్పోకాంపస్‌లో ఎక్కువగా వ్యక్తీకరించబడింది, మరియు ఇది డెన్డ్రిటిక్ ఆర్బరైజేషన్ మరియు డెన్డ్రిటిక్ సంక్లిష్టతలో కీలక పాత్ర పోషిస్తుంది, డెన్డ్రిటిక్ బ్రాంచ్ టిప్ నంబర్ మరియు మొత్తం డెన్డ్రిటిక్ బ్రాంచ్ పొడవుతో సహా, ప్రసవానంతర న్యూరోజెనిసిస్ 16, 18, 24 . - కాటెనిన్ యొక్క వ్యక్తిగత అవశేషాల వద్ద పనితీరు లేదా ఉత్పరివర్తనలు కోల్పోవడం మెదడు వైకల్యానికి కారణమవుతుంది 36, 37 . హిప్పోకాంపల్ డిజిలోని ప్రసవానంతర నవజాత న్యూరాన్లలోని β-catenin cKO లోపభూయిష్ట డెన్డ్రిటిక్ పదనిర్మాణ శాస్త్రానికి దారితీస్తుంది. - కాటెనిన్ మాదిరిగా, BCAS2 మెదడులో ఎక్కువగా వ్యక్తీకరించబడుతుంది (అనుబంధ Fig. S1), మరియు ప్రపంచ BCAS2 KO పిండం ప్రాణాంతకం 10 . ఈ పరిశోధనలు BCAS2 మరియు β-catenin ల మధ్య బలమైన క్రియాత్మక సహసంబంధాన్ని సూచిస్తాయి.

BCAS2 β- కాటెనిన్ యొక్క వ్యక్తీకరణ స్థాయిని నియంత్రించగలదు, ఇది డెండ్రైట్ వృద్ధిని 16, 18 నియంత్రిస్తుంది. ఈ అధ్యయనంలో, BCAS2 cKO ఎలుకలు ప్రసవానంతర DG లో డెన్డ్రిటిక్ అభివృద్ధి సమయంలో డెండ్రైట్ పొడిగింపు తగ్గినట్లు చూపించాయి. ప్రాధమిక న్యూరాన్లలో BCAS2 నాక్‌డౌన్‌తో β- కాటెనిన్ యొక్క అతిగా ప్రసరణ డెన్డ్రిటిక్ వృద్ధిని పునరుద్ధరించింది (Fig. 8). Results-catenin బాహ్యంగా వ్యక్తీకరించబడినప్పుడు ఈ ఫలితాలు పెరిగిన డెన్డ్రిటిక్ ఆర్బరైజేషన్‌కు అనుగుణంగా ఉంటాయి. అందువల్ల, BCAS2 cKO ఎలుకలు డెన్డ్రిటిక్ వైకల్యాన్ని ప్రదర్శిస్తాయి, కనీసం పాక్షికంగా, తగ్గిన β- కాటెనిన్ వ్యక్తీకరణ ద్వారా.

ఇక్కడ, ముందరి భాగంలో BCAS2 నాకౌట్ మెదడు పరిమాణం మరియు బలహీనమైన అభ్యాసం మరియు జ్ఞాపకశక్తికి దారితీసిందని మేము చూపించాము. మెదడు పదనిర్మాణం పరంగా, BCAS2 cKO ఎలుకలు మైక్రోసెఫాలీ లాంటి సమలక్షణాన్ని ప్రదర్శించాయి (Fig. 3). నవజాత న్యూరాన్లు లేకపోవడం, కణాల మరణం లేదా డెండ్రైట్ పొడవు మరియు సంక్లిష్టతలో మార్పులు వంటి అనేక కారణాల వల్ల తగ్గిన ఫోర్‌బ్రేన్ పరిమాణం సంభవించవచ్చు. అయినప్పటికీ, DG లోని న్యూయున్-పాజిటివ్ కణాలు WT మరియు BCAS2 cKO ఎలుకల మధ్య గణనీయంగా భిన్నంగా లేవు మరియు BCAS2 cKO ఎలుకలలోని న్యూయున్-పాజిటివ్ సెల్ సాంద్రత WT (Fig. 3) కంటే ఎక్కువగా ఉంది. BCAS2 యొక్క దిగువ ప్రభావవంతమైన β- కాటెనిన్ హిప్పోకాంపల్ న్యూరాన్స్ 16 లో వ్యక్తీకరించబడిందని స్పష్టమైంది. ప్రస్తుత అధ్యయనంలో, BCAS2 cKO ఎలుకల (Fig. S3) యొక్క హిప్పోకాంపస్‌లో β- కాటెనిన్ స్థాయిని IFA ప్రదర్శించింది. CKO ఎలుకలలో, సంక్షిప్త డెన్డ్రిటిక్ పొడవు మరియు తగ్గిన డెన్డ్రిటిక్ సంక్లిష్టత వరుసగా GG కణిక కణాలు మరియు DCX- పాజిటివ్ అపరిపక్వ న్యూరాన్లలో వరుసగా గోల్గి-ఇంప్రెగ్నేషన్ (Fig. 5) మరియు ఇమ్యునోస్టెయినింగ్ (Fig. 6) ద్వారా వెల్లడైంది. హిప్పోకాంపల్ DG లో డెన్డ్రిటిక్ అభివృద్ధిలో β- కాటెనిన్ ముఖ్యమైన పాత్రలను పోషిస్తుంది. మా ఫలితాలు ఈ ఫలితాలకు అనుగుణంగా ఉన్నాయి; అందువల్ల G- కాటెనిన్ DG న్యూరాన్ల యొక్క డెన్డ్రిటిక్ అర్బర్‌లపై BCAS2 యొక్క ప్రభావాన్ని మధ్యవర్తిత్వం చేయవచ్చు.

BCAS2 cKO ఎలుకలు మోరిస్ వాటర్ మేజ్ అస్సే మరియు నిష్క్రియాత్మక ఎగవేత పరీక్ష రెండింటిలోనూ నేర్చుకోవడం మరియు జ్ఞాపకశక్తి లోపాలను చూపించాయి. ఒక చిన్న మెదడు పరిమాణం అభిజ్ఞా లోపాలతో బలంగా ముడిపడి ఉంటుంది. ఉదాహరణకు, రసాయన-ప్రేరిత ఎలుక మైక్రోసెఫాలీ పుట్టుకతో వచ్చే మెదడు లోపాలతో సంబంధం ఉన్న న్యూరో బిహేవియరల్ అసాధారణతలను ఉత్పత్తి చేస్తుంది. ఎక్స్‌ట్రాసెల్యులర్ సిగ్నల్-రెగ్యులేటెడ్ కినేస్ 2 (ERK2) ప్రోటీన్ స్థాయిలు ఉన్న రోగులు అభ్యాస వైకల్యాలతో క్లినికల్ మైక్రోసెఫాలీని చూపిస్తారు 38, మరియు ERK2- శూన్య ఎలుకలు నాడీ పుట్టుకతో బలహీనమైన విస్తరణతో సంబంధం ఉన్న మైక్రోసెఫాలీని చూపుతాయి. అంతేకాకుండా, వృద్ధాప్యం తేలికపాటి అభిజ్ఞా బలహీనత మరియు చిత్తవైకల్యాన్ని ప్రేరేపిస్తుంది, ఇది హిప్పోకాంపల్ క్షీణత 39, 40 ద్వారా నిర్ధారించబడుతుంది. దీనికి విరుద్ధంగా, పెద్ద హిప్పోకాంపస్ మంచి జ్ఞాపకశక్తి మరియు అభిజ్ఞా పనితీరు 40, 41 తో దగ్గరి సంబంధం కలిగి ఉంటుంది. BCAS2- శూన్య-ప్రేరిత మైక్రోసెఫాలీపై మరింత అవగాహన పొందడానికి ఫోర్బ్రేన్ (సెరిబ్రల్ కార్టెక్స్ వంటివి) మరియు BCAS2 cKO యొక్క పుట్టుకతో విస్తరించడం గురించి పరిశోధించడం విలువైనదే.

సాధారణంగా, న్యూరోజెనిసిస్‌లో న్యూరల్ స్టెమ్ సెల్ (ఎన్‌ఎస్‌సి) విస్తరణ మరియు భేదం, అక్షసంబంధ మరియు డెన్డ్రిటిక్ స్పెసిఫికేషన్, ఎన్‌ఎస్‌సి పరిపక్వత మరియు నవజాత కణాల సినాప్టోజెనిసిస్ ఉంటాయి. ఇక్కడ, BCAS2 యొక్క నష్టం నవజాత న్యూరాన్ల యొక్క డెన్డ్రిటిక్ పెరుగుదలను దెబ్బతీస్తుందని మేము BrdU ట్రేసింగ్ చూపించాము (Fig. 6d, e). అందువల్ల, సికెఓ ఎలుకలలో బలహీనమైన డెన్డ్రిటిక్ అభివృద్ధి BCAS2 లేకపోవడం న్యూరోడెజెనరేటివ్ వ్యాధులకు కారణమవుతుందని సూచిస్తుంది, ఇది అల్జీమర్స్ వ్యాధి (AD) రోగుల యొక్క మునుపటి నివేదికలకు BCAS2 42 యొక్క తక్కువ mRNA వ్యక్తీకరణను చూపిస్తుంది. అంతేకాకుండా, AD రోగులు హిప్పోకాంపల్ వాల్యూమ్ 43 ను కూడా తగ్గించారు. AD లో BCAS2 ఎలా పాల్గొంటుందో లేదో మరింత దర్యాప్తు అవసరం. ఇంకా, న్యూరోడెజెనరేటివ్ వ్యాధులు వేర్వేరు న్యూరాన్ జనాభాను క్రమంగా కోల్పోవడం ద్వారా ప్రేరేపించబడతాయి మరియు అవి తరచుగా అక్షసంబంధ మరియు డెన్డ్రిటిక్ క్షీణతను కలిగి ఉంటాయి, ఇది సినాప్టిక్ ట్రాన్స్మిషన్ లోటులకు దారితీస్తుంది 44, 45 . AD కాకుండా, స్కిజోఫ్రెనియా 46, మేజర్ డిప్రెషన్ 47 మరియు టెంపోరల్ లోబ్ ఎపిలెప్సీ 48 వంటి అనేక న్యూరానల్ డిజార్డర్స్ హిప్పోకాంపల్ వాల్యూమ్ 49 ను తగ్గించాయి. యుక్తవయస్సులో హిప్పోకాంపస్ యొక్క సంకోచం జ్ఞాపకశక్తి బలహీనపడటానికి మరియు చిత్తవైకల్యం 50 కి వచ్చే ప్రమాదానికి దారితీస్తుంది. ఇక్కడ, BCAS2 cKO ఎలుకలు బలహీనమైన అభ్యాసం మరియు జ్ఞాపకశక్తితో చిన్న మెదడు పరిమాణాన్ని కలిగి ఉన్నాయని మేము కనుగొన్నాము మరియు అవి హిప్పోకాంపస్ (అత్తి 3, 4, 5 మరియు 6) యొక్క లోపభూయిష్ట డెన్డ్రిటిక్ ఆర్బరైజేషన్‌ను కూడా ప్రదర్శించాయి. ఈ ఫలితాలు బలహీనమైన డెన్డ్రిటిక్ అభివృద్ధికి అనుగుణంగా ఉంటాయి, ఇది హిప్పోకాంపల్ క్షీణతకు దారితీస్తుంది, జ్ఞాపకశక్తి 51 పై ప్రభావాలతో.

BCAS2 RNA స్ప్లికింగ్ 7, 8 ను నియంత్రిస్తుంది. డ్రోసోఫిలా బిసిఎఎస్ 2 డెల్టా ప్రీ-ఎంఆర్ఎన్ఎ స్ప్లికింగ్‌లో పాల్గొంటుందని మరియు డ్రోసోఫిలా వింగ్ డెవలప్‌మెంట్ 12 లో డెల్టా-నాచ్ సిగ్నలింగ్‌ను నియంత్రిస్తుందని నివేదించబడింది. న్యూరోజెనిక్ SGZ మరియు సబ్‌వెంట్రిక్యులర్ జోన్ (SVZ) ప్రాంతాలలో, డెల్టా-నాచ్ సిగ్నలింగ్ న్యూరాన్ మూలకణాల జనాభాను నిర్వహిస్తుంది 52 మరియు హిప్పోకాంపల్ DG 52 లో డెన్డ్రిటిక్ అభివృద్ధిలో కూడా పాల్గొంటుంది. MCF7 కణాలలో, BCAS2 డెల్టా RNA స్ప్లికింగ్ (సప్లిమెంటరీ Fig. S4a) ను నియంత్రిస్తుంది, గతంలో 12 నివేదించింది. అయినప్పటికీ, డెల్టా యొక్క mRNA మరియు ప్రోటీన్ వ్యక్తీకరణ WT మరియు BCAS2 cKO ఎలుకల మెదడు కణజాలాలలో తేడా లేదు (అనుబంధ Fig. S4b, c). అందువల్ల, డెల్టా-నాచ్ సిగ్నలింగ్ ద్వారా హిప్పోకాంపల్ ప్రాంతంలో డెన్డ్రిటిక్ అభివృద్ధిని BCAS2 నియంత్రించకపోవచ్చు. అదేవిధంగా, PLRG1- లోపం ఉన్న మౌస్ పిండం ఫైబ్రోబ్లాస్ట్‌లలో p53, సైక్లిన్ D1, సైక్లిన్ E1 మరియు ట్యూబులిన్ వంటి క్లిష్టమైన సెల్ సైకిల్ రెగ్యులేటర్లతో సహా బహుళ పరీక్షించిన RNA ల యొక్క స్ప్లికింగ్ ప్రభావితం కాలేదు. అందువల్ల, జన్యు వ్యక్తీకరణ నమూనాను నియంత్రించడానికి వివిధ కణజాలాలు నిర్దిష్ట జన్యు స్ప్లికింగ్ కోసం వేర్వేరు స్ప్లికింగ్ కారకాలను సమీకరించవచ్చు.

AD రోగుల యొక్క మైక్రోఅరే విశ్లేషణలో BCAS2 మరియు β-catenin యొక్క వ్యక్తీకరణ తగ్గింది; అందువల్ల, ఈ జన్యువులను AD- సంబంధిత జన్యువులు 42 గా వర్గీకరించారు. BCAS2 జన్యు లోకిలోని ఒకే న్యూక్లియోటైడ్ పాలిమార్ఫిజం ఆటిజం 53 తో సంబంధం కలిగి ఉంది. ఆటిజం ఉన్న పిల్లలకు మానసిక రుగ్మతలు ఉంటాయి. అందువల్ల, BCAS2 వ్యక్తీకరణ తగ్గడం లేదా BCAS2 మ్యుటేషన్ న్యూరోనల్ డీజెనరేటివ్ వ్యాధులలో పాల్గొనవచ్చు. న్యూరోడెజెనరేటివ్ వ్యాధులలో β- కాటెనిన్ స్థాయిని (జిఎస్కె -3β ఇన్హిబిటర్ వంటివి) పెంచడానికి ప్రస్తుత చికిత్సా విధానాలు అభివృద్ధిలో ఉన్నాయి 54 . BCAS2 β- కాటెనిన్ స్థాయిని నియంత్రించగలదని మేము కనుగొన్నాము, ఇది డెండ్రైట్ వృద్ధిని నియంత్రించగలదు. అందువల్ల, BCAS2 న్యూరోడెజెనరేటివ్ వ్యాధులకు చికిత్సా లక్ష్యం కూడా కావచ్చు.

సారాంశంలో, BCAS2 అనేది β- కాటెనిన్ జన్యు వ్యక్తీకరణ యొక్క అప్‌స్ట్రీమ్ రెగ్యులేటర్, మరియు ఇది డెండ్రైట్ పెరుగుదలలో పాత్ర పోషిస్తుంది, కనీసం పాక్షికంగా β- కాటెనిన్ ద్వారా. మా డేటా BCAS2- శూన్య-ప్రేరిత చిన్న మెదడు పరిమాణం డెండ్రైట్ వైకల్యం వల్ల సంభవించవచ్చు, తద్వారా అభిజ్ఞా లోటు ఏర్పడుతుంది.

సామాగ్రి మరియు పద్ధతులు

ఎక్సాన్ అర్రే విశ్లేషణ

RNA ను TRIzol రియాజెంట్‌తో సంగ్రహించి, BCAS2 ను shBCAS2 # 14 ద్వారా క్షీణించిన తరువాత MCF7 నుండి RNeasy Minikit (Qiagen) తో శుద్ధి చేశారు. అఫిమెట్రిక్స్ హ్యూమన్ ఎక్సాన్ 1.0 ఎస్టీ శ్రేణిని ఉపయోగించి నేషనల్ హెల్త్ రీసెర్చ్ ఇన్స్టిట్యూట్ (ఎన్‌హెచ్‌ఆర్‌ఐ, తైవాన్) లోని మైక్రోఅరే కోర్ సౌకర్యం ద్వారా ఆర్‌ఎన్‌ఏ నమూనాలను విశ్లేషించారు. ఆన్‌లైన్ మాన్యువల్ (//code.google.com/p/altanalyze/wiki/AboutUs#Citing) ప్రకారం ఆల్ట్అనలైజ్ సాఫ్ట్‌వేర్ ద్వారా ప్రత్యామ్నాయ స్ప్లికింగ్ సంఘటనలు మరియు జన్యు వ్యక్తీకరణ ప్రొఫైల్‌లు were హించబడ్డాయి మరియు ఉత్పత్తి చేయబడ్డాయి.

లక్ష్య వెక్టర్ మరియు BCAS2- ఫ్లోక్స్డ్ ఎలుకల నిర్మాణం

BCAS2 జన్యువు యొక్క 1 నుండి 7 వరకు ఎక్సోన్లు కలిగిన మౌస్ జెనోమిక్ DNA యొక్క 16.1-kb భాగం BAC క్లోన్ (bMQ-122M7) నుండి తిరిగి పొందబడింది. ఈ భాగాన్ని pL253 వెక్టర్ యొక్క NotI-SpeI సైట్‌లోకి చేర్చారు, దీనిలో MC1-TK (థైమిడిన్ కినేస్) ప్రతికూల ఎంపిక మార్కర్ 55 ను అందిస్తుంది. ఈ నిర్మాణం తరువాత పిఎల్ 452 నుండి లోక్స్ పి సీక్వెన్స్ మరియు పిఎల్ 451 నుండి నియో క్యాసెట్ (5′-FRT-PGK-NeobpA-FRT-loxP-3 ′) ను వరుసగా పిఎల్ 451 నుండి ఇంట్రాన్స్ 2 మరియు 4 లోకి చొప్పించడానికి వెన్నెముకగా ఉపయోగించబడింది. తుది లక్ష్య నిర్మాణంలో 5 ′ చివరలో 8.1 kb హోమోలాగస్ చేతులు మరియు 3 ′ ముగింపులో 4 kb చేతులు ఉన్నాయి. టార్గెటింగ్ వెక్టర్ ప్రత్యేకమైన నోటిఐ సైట్ వద్ద డిఎన్ఎ జీర్ణక్రియ ద్వారా సరళీకరించబడింది మరియు R1 హైబ్రిడ్ ES కణాలలో ఎలక్ట్రోపోరేట్ చేయబడింది. లక్ష్యంగా ఉన్న క్లోన్‌లను జి 418 ఎంపిక చేసింది. G418- రెసిస్టెంట్ ES కణాలు C57BL / 6JNarl మూలం యొక్క బ్లాస్టోసైట్‌లలోకి చొప్పించబడ్డాయి మరియు హోమోలాగస్ రీకంబినేషన్ ఈవెంట్ (డేటా చూపబడలేదు) కోసం సదరన్ బ్లాటింగ్ ద్వారా అభ్యర్థి ES కణాలు ధృవీకరించబడిన తరువాత నకిలీ-గర్భిణీ పెంపుడు తల్లులలో అమర్చబడ్డాయి. ఫలిత చిమెరాస్ జెర్మ్-లైన్ ట్రాన్స్మిషన్ను స్థాపించడానికి జతచేయబడ్డాయి, మరియు ఎలుకల BCAS2 ఫ్లోక్స్ / ఫ్లోక్స్ లైన్ను స్థాపించడానికి భిన్నమైన (BCAS2 ఫ్లోక్స్ / + ) జంతువులను ఇంటర్‌క్రాస్ చేశారు.

BCAS2 షరతులతో కూడిన నాకౌట్ ఎలుకల తరం మరియు జన్యురూపం

ఫోర్బ్రేన్-నిర్దిష్ట నాకౌట్ ఎలుకలను పొందటానికి, BCAS2 ఫ్లోక్స్ / + ; CaMKIIα-iCre + ఎలుకలను పొందటానికి BCAS2 ఫ్లోక్స్ / ఫ్లోక్స్ ఎలుకలను CaMKIIα-iCre ట్రాన్స్జెనిక్ ఎలుకలతో దాటారు. క్రీ రీకాంబినేస్‌ను వ్యక్తీకరించే CaMKIIα-iCre ట్రాన్స్‌జెనిక్ ఎలుకలు CaMKIIα ప్రమోటర్ చేత BAC- వ్యక్తీకరించే వెక్టర్ 26 లో నియంత్రించబడ్డాయి . క్రీ జన్యువు ఉనికిని పిసిఆర్ ధృవీకరించారు. అప్పుడు, BCAS2 ఫ్లోక్స్ / + ; CaMKIIα-iCre + సంతానం ఒకదానితో ఒకటి దాటబడ్డాయి, ఫలితంగా ఆరు వేర్వేరు జన్యురూపాలు (Fig. 2b). BCAS2 ఫ్లోక్స్ / ఫ్లోక్స్; CaMKIIα-iCre + ఎలుకలను మాత్రమే ఫోర్బ్రేన్-నిర్దిష్ట BCAS2 cKO ఎలుకలుగా పరిగణించారు మరియు ఈ అధ్యయనంలో cKO గా పేరు పెట్టారు; WT ఎలుకలు క్రీస్ జన్యువును కలిగి ఉన్న BCAS2 + / + CaMKIIα-iCre + ట్రాన్స్జెనిక్ ఎలుకలు. సంతానం యొక్క జన్యురూపాలను నిర్ధారించడానికి, డైరెక్ట్‌పిసిఆర్ లైసిస్ రీజెంట్ (వయాజెన్) ను ఉపయోగించి మౌస్ తోక నుండి జన్యుసంబంధమైన DNA సేకరించబడింది మరియు PCR చే విశ్లేషించబడింది.

ఇమ్యునోహిస్టోకెమిస్ట్రీ (IHC) మరియు ఇమ్యునోఫ్లోరోసెన్స్ అస్సే (IFA)

ఎలుకలను అవర్టిన్‌తో మత్తుమందు చేసి, ట్రాన్స్‌కార్డియల్‌గా 4% పారాఫార్మల్డిహైడ్ (పిఎఫ్‌ఎ) తో పెర్ఫ్యూజ్ చేసి, ఆపై ఉచిత తేలియాడే విభాగాలు 30 కోసం వైబ్రాటోమ్ ద్వారా 40 μm వద్ద కరోనల్‌గా విభజించారు. పారాఫిన్-ఎంబెడెడ్ కణజాలం 4 లేదా 10 μm వద్ద విభజించబడింది. నిస్ల్ స్టెయినింగ్ కోసం, 4-μm మెదడు విభాగాలు 1% క్రెసిల్ వైలెట్ (సిగ్మా-ఆల్డ్రిచ్) తో తడిసినవి. IHC మరియు IFA కొరకు, పారాఫిన్-ఎంబెడెడ్ విభాగాలు లేదా ఫ్రీ-ఫ్లోటింగ్ విభాగాలు సూచించిన ప్రతిరోధకాలతో (సప్లిమెంటరీ టేబుల్ S2) పొదిగేవి. IFA కోసం, సై 3-కంజుగేటెడ్ మేక యాంటీ-మౌస్ లేదా అలెక్సా ఫ్లోర్ 488-కంజుగేటెడ్ మేక యాంటీ రాబిట్ సెకండరీ యాంటీబాడీతో పొదిగే ద్వారా ఫ్లోరోసెన్స్ సిగ్నల్స్ ఉత్పత్తి చేయబడ్డాయి. The images were acquired with a Leica TSC SP5 confocal microscope.

గొల్గి మరక

Brain samples were incubated in the impregnation solution of a Rapid GolgiStain kit (FD NeuroTecnologies) at room temperature for 3 weeks. Samples were sliced into 150-μm sections using a vibratome. Morphological analysis of DG granule cells involved light microscopy (Olympus) combined with Stereo Investigator system software (Microbrightfield Bioscience). The granule cell morphology was reconstructed, Scholl analysis was performed, and the dendritic length, dendritic segments, and branch order were analyzed using Neurolucida and Neurolucida Explorer software (Microbrightfield Bioscience). The density of dendritic spines was determined using ImageJ software (US National Institutes of Health).

DG volume analysis

A series of every 12th vibratome section (480 μm apart) throughout the hippocampus was examined using IHC with anti-NeuN antibody and was digitized with a 10× objective lens 29 . The DG area of every section was measured using ImageJ. The DG volume was calculated by multiplying the DG area with the section thickness (40 μm) and the number of sections (1-in-12 series of coronal sections) to obtain DG volume = (sum of the NeuN + DG areas in every section) × 40 × 12.

Dendrite growth

For detection of the dendrite growth, mice of each genotype were intraperitoneally injected with BrdU at 50 mg/kg daily for 5 consecutive days and then scarified 28 days after the first BrdU injection. Fixative brains were prepared as serial vibratome sections for IFA analysis. Series of every 12 th vibratome section throughout hippocampus were first rinsed in PBS for 5 min, incubated in 2N HCl at 40 °C 30 min followed by 0.1 M borate buffer (pH 8.4) at room temperature for 10 min, and then followed the IFA procedure. The morphological characteristics of DCX + Cre + and BrdU + DCX + Cre + neurons were divided into two categories; stage A of immature neurons was defined as a lack of dendrites or the presence of only short dendrites, and stage B featured a long and complicated dendrite morphology 16 .

ప్రవర్తనా పరీక్షలు

Mice at 8 weeks of age were habituated to the test environments for 30 min before all behavioral tests 56 . The locomotor activity was evaluated in open field boxes (40 × 40 cm; San Diego Instruments). For the Morris water maze, a swimming pool (100 cm in diameter) was divided into four quadrants. Every mouse underwent 4 training trials per day (15-min interval between trails) for 4 consecutive training days. In each trial, the mice started swimming from the diagonal quadrant of the target quadrant (where the platform located) and were then allowed to explore the platform hidden beneath the water surface for 60 s. The duration of exploration was measured from the initial swimming to standing on the platform and defined as the escape latency. Twenty-four hours after the last training trial, the platform was removed, and all mice were given a one-minute probe trial to test whether they remembered the location of the platform (target quadrant). The mice were tracked using EthoVision 3 (Noldus Information Technology Inc.). For passive avoidance, mice were examined with the Gemini avoidance system (San Diego Instruments) as previously described 56 with a modification in which the foot shock condition was set to 0.1 mA/10 g body weight for 3 s. Briefly, on the first day, the mouse was placed in the light compartment and allowed to explore the environment for 30 s. After exploration, the guillotine door between the light and dark compartments was raised, and the time used by each mouse to enter the light compartment was recorded. On the second day, once the mouse entered the dark compartment with all four paws, an electric shock was administered, and then the mouse was returned to the home cage. On the third day, the mouse was placed in the light chamber again. After the guillotine door was raised, the retention time of the mouse in the light chamber was recorded, and the maximum time was set to 300 s.

వెస్ట్రన్ బ్లాట్ విశ్లేషణ

Protein lysates were extracted and subjected to western blot analysis with the antibodies indicated in Supplementary Table S2 according to a previously described method 4 .

RT-PCR and quantitative PCR

The total RNA of cells and murine forebrains was extracted using TRI reagent (Invitrogen). Oligo-dT and random hexamers were used to synthesize cDNA for detecting mRNA and pre-mRNA, respectively. The sequences of primers are listed in Supplementary Table S3.

సెల్ సంస్కృతి మరియు బదిలీ

Plasmids and siRNA were transiently transfected into MCF7 and N2A cells for 48 h using jetPRIME (Polyplus). The method of isolating primary neurons from forebrains of E18.5 embryos has been previously described 57 . Briefly, coverslips were precoated with 1 mg/ml poly-D-lysine; then, primary neurons were seeded at 10 5 cells/well in 24-well plates. Cells were cultured in Neurobasal medium (Invitrogen) supplemented with 2% B27 (Invitrogen), 0.5 mM L-glutamine, 100 U/ml penicillin, and 100 mg/ml streptomycin. Transfection was performed using the calcium phosphate method. After transfection for 5 days, cells were fixed and analyzed using immunofluorescence, and the dendrite length was measured. The dendrites of primary neurons were measured using the MAP-2 expression in protrusions >10 μm from the soma; then, calculations were performed using Neurolucida and Neurolucida Explorer software (Microbrightfield Bioscience). The fluorescence images of primary neurons were obtained by confocal microscopy (Leica TCS SP5).

గణాంక విశ్లేషణ

Statistical comparisons were performed using the two-tailed Student's t -test, one-way ANOVA, and repeated measure two-way ANOVA (followed by post hoc Bonferroni's test) for independent samples with Microsoft Excel 2010 and StatPlus software. The data are presented as the mean ± SEM or SD. * P < 0.05 and ** P < 0.01 were considered statistically significant.

అధ్యయనం ఆమోదం

All procedures of the animal experiments were reviewed and approved by the Institutional Animal Care and Use Committee at the College of Medicine, National Taiwan University (IACUC) and all experiments were performed in accordance with the approved relevant guidelines and regulations. All experimental mice were housed in the animal center under a 12-h light/dark cycle with free access to food and water.

అదనపు సమాచారం

How to cite this article : Huang, C.-W. మరియు ఇతరులు . Conditional Knockout of Breast Carcinoma Amplified Sequence 2 (BCAS2) in Mouse Forebrain Causes Dendritic Malformation via β-catenin. సైన్స్. Rep. 6, 34927; doi: 10.1038/srep34927 (2016).

అనుబంధ సమాచారం

PDF ఫైళ్లు

  1. 1.

    అనుబంధ సమాచారం

వ్యాఖ్యలు

వ్యాఖ్యను సమర్పించడం ద్వారా మీరు మా నిబంధనలు మరియు సంఘ మార్గదర్శకాలకు కట్టుబడి ఉండాలని అంగీకరిస్తున్నారు. మీరు దుర్వినియోగమైనదాన్ని కనుగొంటే లేదా అది మా నిబంధనలు లేదా మార్గదర్శకాలకు అనుగుణంగా లేనట్లయితే దయచేసి దాన్ని అనుచితమైనదిగా ఫ్లాగ్ చేయండి.