హోస్ట్ కణాలపై టోల్-లాంటి గ్రాహక 3/7/9 లోపం కణితి పెరుగుదల యొక్క టి-సెల్-ఆధారిత నియంత్రణకు దారితీస్తుంది | ప్రకృతి సమాచార మార్పిడి

హోస్ట్ కణాలపై టోల్-లాంటి గ్రాహక 3/7/9 లోపం కణితి పెరుగుదల యొక్క టి-సెల్-ఆధారిత నియంత్రణకు దారితీస్తుంది | ప్రకృతి సమాచార మార్పిడి

Anonim

విషయము

  • క్యాన్సర్ సూక్ష్మ పర్యావరణం
  • కణితి రోగనిరోధక శాస్త్రం

నైరూప్య

టోల్-లాంటి గ్రాహకాలు (టిఎల్‌ఆర్‌లు) సెల్ ఉపరితలంపై లేదా కణాంతర ఎండోజోమ్‌లలో ఉంటాయి మరియు వాటి క్రియాశీలత సాధారణంగా రక్షిత రోగనిరోధక ప్రతిస్పందనల ప్రేరణకు దోహదం చేస్తుంది. అయినప్పటికీ, క్యాన్సర్‌లో ఎండోజెనస్ లిగాండ్స్ ద్వారా వాటి క్రియాశీలత కణితి పురోగతిని మాడ్యులేట్ చేస్తుంది. ఎండోజోమల్ టిఎల్‌ఆర్‌లు ఎండోజెనస్ యాంటీ-ట్యూమర్ రోగనిరోధక శక్తిని ఎలా నియంత్రిస్తాయో ప్రస్తుతం తెలియదు. ప్రారంభ కణాల పెరుగుదల తరువాత, హోస్ట్ కణాలపై TLR3, 7 మరియు 9 లోపాలు, పూర్తి కణితి రిగ్రెషన్ మరియు యాంటీ-ట్యూమర్ రోగనిరోధక శక్తిని ప్రేరేపిస్తాయని ఇక్కడ మేము చూపించాము. కణితి రిగ్రెషన్‌కు మూడు గ్రాహకాల కలయిక లేకపోవడం అవసరం, ఇది సిడి 4 మరియు సిడి 8 టి కణాలపై ఆధారపడి ఉంటుంది మరియు ఎలుకలను తదుపరి కణితి సవాలు నుండి రక్షిస్తుంది. నియంత్రణ ఎలుకలలోని కణితులు అధిక సంఖ్యలో రెగ్యులేటరీ టి కణాల ద్వారా చొరబడినప్పటికీ, టిఎల్ఆర్-లోపం ఉన్న ఎలుకలలో కణితి రిగ్రెషన్ మార్చబడిన వాస్కులర్ స్ట్రక్చర్ మరియు సైటోటాక్సిక్ మరియు సైటోకిన్-ఉత్పత్తి చేసే ఎఫెక్టర్ టి కణాల బలంగా ప్రేరేపించబడి ఉంటుంది. అందువల్ల, ఎండోసోమల్ టిఎల్‌ఆర్‌లు ఎర్రబడిన కణితి కణ సమలక్షణం, యాంటీ-ట్యూమర్ రోగనిరోధక శక్తి మరియు టి-సెల్ యాక్టివేషన్ నియంత్రణ మధ్య పరమాణు సంబంధాన్ని సూచిస్తాయి.

పరిచయం

టోల్-లాంటి గ్రాహకాలు (టిఎల్‌ఆర్‌లు) గ్రాహకాల యొక్క సంరక్షించబడిన కుటుంబం, వ్యాధికారక నిర్మాణాలకు ప్రతిస్పందించే వారి సామర్థ్యానికి బాగా గుర్తించబడ్డాయి, వీటిని వ్యాధికారక-అనుబంధ పరమాణు నమూనాలు 1 అని కూడా పిలుస్తారు. TLR లు సెల్ ఉపరితలంపై లేదా కణాంతర ఎండోజోమ్‌లలో ఉంటాయి. TLR2 మరియు TLR4 వంటి ఉపరితల TLR లు ప్రధానంగా బ్యాక్టీరియా ప్రోటీన్లను గుర్తించినప్పటికీ, ఎండోసోమల్ TLR లు ప్రధానంగా వైరల్ మరియు బాక్టీరియల్ న్యూక్లియిక్ ఆమ్లాలను గుర్తించాయి. TLR లను ప్రేరేపించడం సక్రియం చేయబడిన కణాలలో సంక్లిష్టమైన కణాంతర సిగ్నలింగ్ క్యాస్కేడ్‌ను ప్రారంభిస్తుంది. ఇతరులలో, MyD88 మరియు TRIF ఈ క్యాస్కేడ్‌లోని ప్రధాన అడాప్టర్ అణువులు. రోగనిరోధక వ్యవస్థలో, టిఎల్ఆర్ బంధం మైలోయిడ్ కణాల క్రియాశీలతకు దారితీస్తుంది మరియు తరువాత యాంటీ-పాథోజెనిక్ రోగనిరోధక శక్తిని ప్రేరేపిస్తుంది. ఈ సందర్భంలో, TLR ల ద్వారా మైలోయిడ్ రోగనిరోధక కణాల క్రియాశీలత సహజమైన మరియు అనుకూల రోగనిరోధక శక్తి 4 మధ్య సంబంధాన్ని సూచిస్తుంది.

సింథటిక్ లేదా సహజ టిఎల్ఆర్ లిగాండ్ల ఆధారంగా క్యాన్సర్ ఇమ్యునోథెరపీలను అభివృద్ధి చేయడానికి టిఎల్ఆర్ లిగేషన్ యొక్క ఈ ఇమ్యునోస్టిమ్యులేటరీ సంభావ్యత ఉపయోగించబడింది. మెమ్బ్రేన్ బౌండ్ మరియు ఎండోసోమల్ టిఎల్ఆర్ ల యొక్క చికిత్సా లిగాండ్స్ రెండింటికి ఉదాహరణలు ఉన్నాయి. ఎండోసోమల్ టిఎల్‌ఆర్‌లను లక్ష్యంగా చేసుకుని, వైరల్ మరియు బ్యాక్టీరియా ఆర్‌ఎన్‌ఎ మరియు డిఎన్‌ఎలను అనుకరించడం కొంతవరకు విస్తృత ఆసక్తిని ఆకర్షించింది. ఉదాహరణలలో ఇమిక్విమోడ్ మరియు సిపిజి, ఎండోసోమల్ టిఎల్‌ఆర్‌లు 7 మరియు 9 లకు లిగాండ్‌లు ఉన్నాయి. ఇమిక్విమోడ్ ఒక చిన్న సింథటిక్ ఆర్‌ఎన్‌ఎ మరియు ఇది ఆక్టినిక్ కెరాటోసిస్, బాహ్య జననేంద్రియ మొటిమలు మరియు మిడిమిడి బేసల్ సెల్ కార్సినోమా 5 చికిత్సకు వైద్యపరంగా ఉపయోగించబడుతుంది. సిపిజి, టిఎల్ఆర్ 9 తో బంధించడం ద్వారా, బలమైన సహాయక చర్యను కలిగి ఉంది మరియు అలెర్జీ, క్యాన్సర్ మరియు అంటు వ్యాధుల చికిత్సలో అనేక క్లినికల్ ట్రయల్స్‌లో వర్తించబడుతుంది.

ఈ చికిత్సా అనువర్తనాల సందర్భంలో, కణితి కణాలపై TLR ల యొక్క వ్యక్తీకరణ మరియు క్యాన్సర్ కణాలపై TLR క్రియాశీలత యొక్క పరిణామాలు పెరుగుతున్న శ్రద్ధను పొందాయి. ఈ ప్రాంతంలో చేసిన అధ్యయనాలు టిఎల్‌ఆర్ లిగాండ్స్‌తో కణితి కణాల ఉద్దీపన యొక్క డైకోటోమస్ స్వభావాన్ని త్వరగా వెల్లడించాయి. ఒక వైపు, TLR లను ప్రేరేపించడం కణితి కణాలలో 7, 8 కణాల మరణాన్ని ప్రేరేపిస్తుందని నివేదించబడింది. ఈ కణ మరణం రెండు విధాలుగా యాంటీ-ట్యూమరల్ కావచ్చు: మొదట, ప్రత్యక్ష పర్యవసానంగా, కణితి కణాల సంఖ్య తగ్గుతుంది. రెండవది, 'ఇమ్యునోజెనిక్ సెల్ డెత్' అని పిలువబడే ఒక ప్రక్రియ ద్వారా, యాంటీ-ట్యూమర్ రోగనిరోధక శక్తి యొక్క అదనపు క్రియాశీలత 9, 10 సంభవించవచ్చు. ఏదేమైనా, ఈ రకమైన ఇమ్యునోజెనిక్ కణాల మరణం RIG-I- లాంటి హెలికేసులపై TLR లిగాండ్ల ప్రభావాలతో సంబంధం కలిగి ఉంటుందని కొన్ని ఆధారాలు సూచిస్తున్నాయి, సింథటిక్ మరియు పాథోజెనిక్ న్యూక్లియిక్ ఆమ్లాలకు ప్రతిస్పందించే మరొక తరగతి నమూనా గుర్తింపు గ్రాహకాలు. దీనికి విరుద్ధంగా, కొన్ని పరిస్థితులలో, టిఎల్ఆర్ లిగాండ్స్ యాంటీ-అపోప్టోటిక్ ఎఫెక్ట్స్ 12 ను కూడా పొందవచ్చు, ఇవి రోగనిరోధక కణాల ద్వారా సైటోలిసిస్ నుండి అదనపు తప్పించుకోవటానికి కూడా సంబంధం కలిగి ఉంటాయి.

క్యాన్సర్ (మరియు ఎపిథీలియల్) కణాలపై ప్రభావాలు బాగా అర్థం చేసుకున్నప్పటికీ, ఫైబ్రోబ్లాస్ట్‌లు మరియు మీసెన్చైమల్ కణాలలో టిఎల్ఆర్ సిగ్నలింగ్ యొక్క పరిణామాలు సరిగా వివరించబడలేదు. కొన్ని అధ్యయనాలు క్యాన్సర్-సంబంధిత ఫైబ్రోబ్లాస్ట్‌లపై TLR వ్యక్తీకరణ యొక్క కణితిని ప్రోత్సహించే ప్రభావాలను సూచిస్తున్నాయి. ఉదాహరణకు, కొలొరెక్టల్ క్యాన్సర్‌లో స్ట్రోమల్ ఫైబ్రోబ్లాస్ట్‌లచే TLR4 వ్యక్తీకరణ పేలవమైన రోగ నిరూపణతో సంబంధం కలిగి ఉంది 14 మరియు ఫైబ్రోబ్లాస్ట్‌లలో TLR3 యొక్క అధిక ప్రసరణ ఫలితంగా ఆంకోప్రొటీన్ సి-మైక్ 15 యొక్క నియంత్రణను కలిగిస్తుంది . ఇతర అధ్యయనాలు రొమ్ము లేదా ఓసోఫాగియల్ స్క్వామస్ సెల్ కార్సినోమాలోని ఫైబ్రోబ్లాస్ట్ లాంటి కణాలపై అధిక TLR9 మెసెంజర్ RNA వ్యక్తీకరణ తగ్గిన మెటాస్టాసిస్ మరియు దండయాత్ర 16, 17 తో సంబంధం కలిగి ఉన్నాయని చూపించాయి.

విదేశీ వ్యాధికారక నిర్మాణాలతో పాటు, TLR లు సాధారణంగా నష్టం-అనుబంధ పరమాణు నమూనా అణువుల (DAMP లు) గా పిలువబడే విదేశీయేతర నిర్మాణాలను కూడా గుర్తిస్తాయి. DAMP లు హోస్ట్ యొక్క స్వీయ-ప్రోటీన్లు, ఇవి దీర్ఘకాలిక మంట, ఆటో ఇమ్యూన్ వ్యాధులు, సెప్సిస్ మరియు క్యాన్సర్ 18 వంటి వ్యాధికారక పరిస్థితులలో విడుదలవుతాయి.

క్యాన్సర్లో, క్యాన్సర్ సంబంధిత మంట, కణజాల నాశనం మరియు కణాల మరణం యొక్క పర్యవసానంగా DAMP లు విడుదల చేయబడతాయి. కణితి కణాల ద్వారా అణు DNA- బైండింగ్ అణువు హై-మొబిలిటీ గ్రూప్ బాక్స్ 1 (HMGB1) విడుదల DC లలో TLR2 మరియు TLR4 ను సక్రియం చేస్తుంది, దీని ఫలితంగా కణితి యాంటిజెన్ల యొక్క సమర్థవంతమైన ప్రాసెసింగ్ మరియు క్రాస్-ప్రెజెంటేషన్ మరియు ట్యూమర్ రిగ్రెషన్ 20, 21 . అదేవిధంగా, S100 కుటుంబ సభ్యులు సెల్యులార్ ఒత్తిడి మరియు క్యాన్సర్ సమయంలో విడుదలవుతారు. రోగనిరోధక కణాలలో, ఇది ప్రో-ఇన్ఫ్లమేటరీ సైటోకిన్స్ యొక్క TLR4- ఆధారిత విడుదలకు దారితీస్తుంది మరియు అధునాతన గ్లైకేషన్ ఎండ్‌ప్రొడక్ట్స్ (RAGE) -ఆధారిత వలస 22 కొరకు గ్రాహకం. అదనంగా, హిస్టోన్లు, న్యూక్లియస్ నుండి ఎక్స్‌ట్రాసెల్యులర్ ప్రదేశానికి బదిలీ చేయబడితే, DAMP లు 23 వలె పనిచేస్తాయి మరియు హిస్టోన్‌ల ప్రసరణ స్థాయిలు కనుగొనబడ్డాయి, ఉదాహరణకు, ప్యాంక్రియాటిక్ క్యాన్సర్ రోగుల సీరం 24 . అదేవిధంగా, నెక్రోటిక్ క్యాన్సర్ కణాలు లేదా ప్రక్కనే గాయపడిన ఎపిథీలియల్ కణాల నుండి విడుదలయ్యే న్యూక్లియిక్ ఆమ్ల శకలాలు DAMP లుగా 25, 26 గా పనిచేస్తాయి.

అందువల్ల, కొన్ని అనిశ్చితులు ఉన్నప్పటికీ, ఎండోజెనస్ లిగాండ్స్ ద్వారా టిఎల్‌ఆర్‌లను నిరంతరం ప్రేరేపించడం ప్రధానంగా కణితిని ప్రోత్సహించే ప్రభావాలతో సంబంధం కలిగి ఉంటుంది. ఈ ప్రభావాలు ఎక్కువగా TLR2 మరియు TLR4 లతో అనుసంధానించబడి ఉంటాయి. TLR3, 7 మరియు 9 వంటి ఎండోసోమల్ TLR ల పాత్ర తక్కువ స్పష్టంగా ఉంది మరియు ఈ అధ్యయనంలో పరిశోధించబడుతుంది. హోస్ట్ కణాలపై TLR వ్యక్తీకరణ యొక్క పాత్రను ప్రత్యేకంగా పరిష్కరించడానికి మేము సింజెనిక్ వైల్డ్-టైప్ (WT) మార్పిడి చేయగల కణితి కణాలు మరియు TLR- లోపం కలిగిన గ్రహీత ఎలుకలను ఉపయోగిస్తాము. మొదటి 7-10 రోజులలో, కణితి పెరుగుదల WT మరియు Tlr3 / 7/9-లోపం ఉన్న ఎలుకలలో వాస్తవంగా సమానంగా ఉంటుంది. T హించని విధంగా, పోస్ట్ 10 వ రోజు Tlr ట్రిపుల్ నాకౌట్ (KO) ఎలుకలలో స్పష్టమైన కణితి తిరస్కరణ గమనించవచ్చు. ఈ దశ నాటకీయ స్థానిక తాపజనక ప్రతిచర్యతో మరియు కణితి సూక్ష్మ వాతావరణంలో గణనీయమైన మార్పులతో ముడిపడి ఉంది, చివరికి T హించని T- సెల్-ఆధారిత పూర్తి కణితి తిరస్కరణను అనుమతిస్తుంది. మొత్తానికి, మా డేటా TLR సిగ్నలింగ్ కణితి-అనుబంధ వాపు మరియు యాంటీ-ట్యూమర్ రోగనిరోధక శక్తి మధ్య పరమాణు సంబంధాన్ని అందించగలదని సూచిస్తుంది.

ఫలితాలు

టిఎల్ఆర్ సిగ్నలింగ్ లేనప్పుడు కణితి తిరస్కరణ

కణితి పెరుగుదలపై ఎండోసోమల్ టిఎల్‌ఆర్‌లు 3, 7 మరియు 9 పాత్రను పరిశోధించడానికి, ఒక మురైన్ హెడ్ మరియు మెడ క్యాన్సర్ సెల్ లైన్ (మురిన్ ఓరోఫారింజియల్ కార్సినోమా సెల్, ఎంఓపిసి) సింగిల్ కెఓ , డబుల్ కెఓ మరియు టిఎల్‌ఆర్ 3/7/9 ట్రిపుల్ కెఓ ఎలుకలలోకి ప్రవేశపెట్టబడింది (Fig. 1a మరియు అనుబంధ Fig. 1). TLR- లోపం మరియు WT నియంత్రణ ఎలుకలలో, 1 వారంలో తాకుతూ ఉండే కణితి అభివృద్ధి చెందింది. సింగిల్ KO ఎలుకల డేటా WT ఎలుకలతో పోల్చదగినది మరియు అందువల్ల బొమ్మలలో ప్రదర్శించబడలేదు. T హించని విధంగా, తరువాతి సమయంలో, కణితులు Tlr3 / 7/9 ట్రిపుల్ KO లో పరిమాణంలో క్షీణించాయి, కానీ ఒకే లేదా డబుల్ KO ఎలుకలు కాదు, మరియు 14 వ రోజు మరియు 30 వ రోజు మధ్య పూర్తిగా అదృశ్యమయ్యాయి (Fig. 1a మరియు అనుబంధ Fig. 1). దీనికి విరుద్ధంగా, ఆరు Tlr3 / 9 - / - ఎలుకలలో ఒకటి మాత్రమే కణితిని తిరస్కరించగలదు మరియు 3-4 వారాల తర్వాత రెండు సింగిల్ KO ఎలుకలు మాత్రమే కణితిని అభివృద్ధి చేయలేదు. ప్రారంభ పెరుగుదల మరియు తరువాత తిరస్కరణ దశలో వేర్వేరు సమయ బిందువులలో WT మరియు Tlr3 / 7/9 - / - ఎలుకల నుండి తీసుకున్న కణితి విభాగాల యొక్క హిస్టోలాజిక్ విశ్లేషణ, కణితి తిరోగమనాన్ని నిర్ధారించింది (Fig. 1b). సెల్ లైన్-నిర్దిష్ట ప్రభావాలను మినహాయించడానికి, Tlr ట్రిపుల్ KO ఎలుకలలో రెండు అదనపు సింజెనిక్ ట్యూమర్ సెల్ లైన్లు (TC1, MB49) ఇంజెక్ట్ చేయబడ్డాయి. WT ఎలుకలలో చేసిన టైట్రేషన్ ప్రయోగాల ప్రకారం ఐనోక్యులమ్ కొరకు సెల్ సంఖ్యలు నిర్ణయించబడ్డాయి. మళ్ళీ, అన్ని TLR3 / 7/9-లోపం ఉన్న ఎలుకలు మరియు WT ఎలుకలు ప్రారంభ 1-2 వారాల పోస్ట్ ఇంజెక్షన్ సమయంలో కణితులను అభివృద్ధి చేశాయి (ఉపయోగించిన సెల్ లైన్‌ను బట్టి), అయితే Tlr ట్రిపుల్ KO ఎలుకలు మాత్రమే 40 రోజుల్లో కణితులను తిరస్కరించాయి (అనుబంధ Fig. 2). ).

Image

( ) MOPC కణితి కణాలు (0.5 × 10 6 ) 8 నుండి 16 వారాల వయస్సు గల C57BL / 6 WT ( n = 19) మరియు Tlr3 / 7/9 - / - ఎలుకల ( n = 24). కణితి పెరుగుదల యొక్క అర్థం ± సెమ్ మరియు ట్యూమర్ టేక్ (తాకుతూ ఉండే కణితితో ఎలుకల శాతం) చూపించబడ్డాయి. మూడు నక్షత్రాలు (***) గణాంక వ్యత్యాసం P 0.0005 ( t -test) ను సూచిస్తాయి. ( బి ) కణితి కణ ఇంజెక్షన్ (రోజు 1 నుండి 28 వరకు) తర్వాత వేర్వేరు సమయ బిందువులలో విచ్ఛిన్నమైన sc కణితుల ఘనీభవించిన విభాగాలు, హేమాటాక్సిలిన్-ఇయోసిన్ మరక ద్వారా తడిసినవి. ప్రతి టైమ్ పాయింట్‌కు ఒక ప్రతినిధి ఉదాహరణ చూపబడుతుంది. స్కేల్ బార్, 1, 000 μm. ( సి ) కణితి కణ ఇంజెక్షన్ తర్వాత 3, రోజు 6, 10 వ రోజు మరియు 14 వ రోజు మొత్తం కణితి ప్రాంతానికి సంబంధించి ట్యూనెల్-పాజిటివ్ కణాల వైశాల్యాన్ని లెక్కించడం ద్వారా MOPC కణితుల్లో చనిపోయిన కణాల పరిమాణాన్ని నిర్ణయించారు ( n = 3–6 ). ఒకే విలువలు మరియు సగటు (క్షితిజ సమాంతర రేఖ) చూపబడతాయి. * P 0.05 మరియు *** P 0.0005 ( t -test) వద్ద ఫలితాలు ముఖ్యమైనవిగా పరిగణించబడ్డాయి. ( డి ) WT మరియు Tlr3 / 7/9 - / - ఎలుకల కణితుల యొక్క 10 వ రోజు మరియు 14 వ రోజు వద్ద TUNEL మరక యొక్క ప్రతినిధి ఉదాహరణలు. ఆకుపచ్చ: ట్యూనెల్, ఎరుపు: 7-AAD న్యూక్లియర్ స్టెయినింగ్. స్కేల్ బార్, 100 μm. ( ) 8- నుండి 12 వారాల వయస్సు గల C57BL / 6 WT ( n = 4) మరియు Tlr3 / 7/9 లో నోటి అంతస్తులో ఆర్థోటోపిక్ (ఆర్థో) ఇంజెక్షన్ తర్వాత 0.5 × 10 6 MOPC కణాల కణితి పెరుగుదల. / - ఎలుకలు ( n = 5). ఎలుకల సాపేక్ష బరువు చూపబడింది. చుక్కల ఎరుపు రేఖ ద్వారా సూచించబడిన ప్రారంభ బరువులో 20% కోల్పోతే ఎలుకలు చంపబడతాయి.

పూర్తి పరిమాణ చిత్రం

కణితి కణాల మరణం వల్ల కణితి రిగ్రెషన్ సంభవిస్తుందో లేదో పరీక్షించడానికి, మేము కణజాల విభాగాలపై టిడిటి-మెడియేటెడ్ డియుటిపి నిక్ ఎండ్ లేబులింగ్ (ట్యూనెల్) మరకను ప్రదర్శించాము. కణితి పెరుగుదల యొక్క మొదటి వారంలో WT మరియు Tlr - / - ఎలుకలలో తక్కువ కణాల మరణం మాత్రమే కనుగొనగలిగినప్పటికీ, TLEL- పాజిటివ్ కణాలలో అనూహ్య పెరుగుదల 10 వ రోజు మరియు 14 వ రోజు TLR- లోపం ఉన్న ఎలుకలలో గమనించబడింది (Fig. 1c, d), రిగ్రెషన్ సమయంలో గణనీయమైన కణితి కణాల మరణాన్ని సూచిస్తుంది.

కణితి పెరుగుదల స్థానిక కణజాల సూక్ష్మ పర్యావరణం ద్వారా ప్రభావితమవుతుంది. ఈ దృగ్విషయం సబ్కటానియస్ (sc) ఇంజెక్షన్ సైట్‌కు పరిమితం కాదా అని అన్వేషించడానికి, మేము తరువాత మా విశ్లేషణను మా గ్రూప్ 28 ఇటీవల అభివృద్ధి చేసిన ఆర్థోటోపిక్ మోడల్‌కు విస్తరించాము. ఈ నమూనాలో, కణితి కణాలు నోటి అంతస్తులోకి చొప్పించబడతాయి మరియు ఎలుకల బరువు కణితి పెరుగుదలకు కొలమానంగా నమోదు చేయబడుతుంది. WT మరియు Tlr - / - బలహీనమైన ఆహారం తీసుకోవడం యొక్క పర్యవసానంగా ప్రారంభ వృద్ధి దశలో ఎలుకలు బరువు తగ్గడం ప్రారంభించాయి. 10 వ రోజు, sc మోడల్‌కు సారూప్యంగా, Tlr - / - ఎలుకలు సాధారణ శరీర బరువుకు కోలుకోవడం ప్రారంభించాయి. దీనికి విరుద్ధంగా, WT ఎలుకలు ప్రగతిశీల కణితి పెరుగుదలను చూపించాయి మరియు జంతు సంక్షేమ నిబంధనల ప్రకారం చంపబడ్డాయి (Fig. 1e). ఈ డేటా కణితి తిరస్కరణ యొక్క విధానం sc సైట్కు మాత్రమే పరిమితం కాదని సూచిస్తుంది, కానీ ఆర్థోటోపిక్ సైట్ వద్ద నిర్వహించబడుతుంది.

కణితి తిరస్కరణలో రోగనిరోధక మరియు రోగనిరోధక కణాలు పాల్గొంటాయి

స్ట్రోమల్ ట్యూమర్ మైక్రో ఎన్విరాన్‌మెంట్‌లో రోగనిరోధక కణాలు మరియు రోగనిరోధక స్ట్రోమల్ కణాలు ఉంటాయి. రోగనిరోధక కణాలు హేమాటోపోయిటిక్ మూలానికి చెందినవి అయినప్పటికీ, మిగిలిన స్ట్రోమల్ కణాలు ఎక్కువగా హేమాటోపోయిటిక్ కానివి మరియు నాళాలు మరియు మెసెన్చైమల్ ఫైబ్రోబ్లాస్టాయిడ్ కణాలను కలిగి ఉంటాయి. కణితి తిరస్కరణ హేమాటోపోయిటిక్ లేదా నాన్-హేమాటోపోయిటిక్ కణాలపై టిఎల్ఆర్ లోపం ద్వారా మధ్యవర్తిత్వం వహించబడిందో లేదో పరీక్షించడానికి మేము క్లాసికల్ ఎముక మజ్జ చిమెరా ప్రయోగాలు చేసాము. Fig. 2a లో చిత్రీకరించినట్లుగా, కణితి తిరస్కరణ రేడియేటెడ్ Tlr - / - ఎలుకలలో మాత్రమే సంభవించింది, ఇది Tlr - / - ఎముక మజ్జను (BM; నియమించబడిన KO నియంత్రణ) పొందింది. కణితి పెరుగుదల కోసం రెండు చిమెరా రకాలు (KT హోస్ట్‌లోకి WT BM మరియు WT హోస్ట్‌లోకి KO BM) అనుమతించబడ్డాయి, ఇది పూర్తి కణితి తిరస్కరణకు హేమాటోపోయిటిక్ మరియు నాన్-హేమాటోపోయిటిక్ స్ట్రోమల్ కణాలపై TLR లోపం అవసరమని సూచిస్తుంది. ప్రయోగం యొక్క 30 వ రోజు (Fig. 2b) కాలిపర్ కొలతల ద్వారా కణితి పెరుగుదలను మేము లెక్కించినప్పుడు, వ్యక్తిగత జంతువుల మధ్య కణితి పరిమాణంలో great హించిన గొప్ప వ్యత్యాసాన్ని మేము కనుగొన్నాము. KO నియంత్రణ ఎలుకలలో ఏ లేదా చాలా చిన్న కణితులను కొలవలేము, అయితే కణితులు WT నియంత్రణలో మరియు రెండు రకాల చిమెరాలో స్పష్టంగా కొలవగలవు. కణితి తిరస్కరణకు హేమాటోపోయిటిక్ మరియు నాన్-హేమాటోపోయిటిక్, రేడియోరేసిస్టెంట్ టిఎల్ఆర్-లోపం గల స్ట్రోమల్ కణాల సహకార కార్యాచరణ అవసరమని ఈ డేటా సూచిస్తుంది.

Image

గ్రహీత ఎలుకల వికిరణం మరియు 1 రోజు తరువాత దాత ఎలుకల నుండి BM బదిలీ ద్వారా BM చిమెరాస్ (8-14 వారాల వయస్సు) ఉత్పత్తి చేయబడ్డాయి. WT ఎలుకలు చిమెరా 1 (ముదురు ఆకుపచ్చ) ను ఉత్పత్తి చేయడానికి Tlr3 / 7/9 - / - ఎలుకల నుండి BM ను అందుకున్నాయి. చిమెరా 2 (లేత ఆకుపచ్చ) ను ఉత్పత్తి చేయడానికి, Tlr3 / 7/9 - / - ఎలుకలు WT BM ను అందుకున్నాయి. నియంత్రణగా, రేడియేటెడ్ WT ఎలుకలు WT BM (నలుపు) మరియు Tlr3 / 7/9 - / - ఎలుకలు TLR- లోపం గల BM (నీలం) ( n = 10–12) ను అందుకున్నాయి. ఎనిమిది వారాల తరువాత, MOPC కణాలు ఇంజెక్ట్ చేయబడ్డాయి మరియు కణితి టేక్ (తాకుతూ ఉండే కణితితో ఎలుకల సంఖ్య) నమోదు చేయబడింది ( ). కణితి వాల్యూమ్ వ్యక్తిగత ఎలుకల కణితి ఇంజెక్షన్ తర్వాత 30 రోజుల తరువాత మరియు సగటు (క్షితిజ సమాంతర రేఖ) ± సెమ్ చూపబడుతుంది; పి- విలువ (వ్యత్యాసం యొక్క విశ్లేషణ) సూచించబడుతుంది ( బి ). * P 0.05 మరియు *** P 0.0005 వద్ద ఫలితాలు ముఖ్యమైనవిగా పరిగణించబడ్డాయి.

పూర్తి పరిమాణ చిత్రం

రక్తనాళాలు నాన్-హేమాటోపోయిటిక్ స్ట్రోమల్ ట్యూమర్ మైక్రో ఎన్విరాన్‌మెంట్‌లో ప్రధాన భాగం. 6 వ మరియు 14 వ రోజు మధ్య సిడి 31 ఇమ్యునోహిస్టోకెమిస్ట్రీ ద్వారా మేము ఓడల కూర్పును విశ్లేషించినప్పుడు, WT మరియు Tlr - / - ఎలుకల మధ్య గణనీయమైన తేడాలు ఉన్నాయి. 10 మరియు 14 వ రోజు, స్థూల మైక్రోస్కోపిక్ తనిఖీ (Fig. 3a) ఇప్పటికే Tlr - / - ఎలుకలలో నాళాల వ్యాసంలో గణనీయమైన పెరుగుదలను సూచించింది. WT ఎలుకలతో (Fig. 3b) పోలిస్తే Tlr - / - సమూహంలో ఓడల వ్యాసంలో రెట్టింపు పెరుగుదలను చూపించే డిజిటల్ ఇమేజ్ విశ్లేషణను ఉపయోగించి ఈ పెరుగుదల ధృవీకరించబడింది మరియు లెక్కించబడింది. రిగ్రెషన్ దశలో (10 మరియు 14 రోజులు), మెరుగైన నాళాల వ్యాసం మైక్రోస్కోపిక్ క్షేత్రానికి నాళాల సంఖ్య తగ్గడంతో పాటు (Fig. 3 సి). ఏదేమైనా, 6 వ రోజు, రిగ్రెషన్ దశకు ముందు, నాళాల వ్యాసం మరియు సాంద్రతలో తేడాలు గమనించబడలేదు. రెండు-డైమెన్షనల్ ఇమ్యునోహిస్టోకెమికల్ విశ్లేషణ నుండి ఈ ఫలితాలను రుజువు చేయడానికి, మేము లైట్ షీట్ మైక్రోస్కోపీ మరియు త్రిమితీయ (3 డి) విశ్లేషణలను ఉపయోగించాము (Fig. 3d మరియు అనుబంధ సినిమాలు 1 మరియు 2). WT ఎలుకలలోని కణితులు ఒక సాధారణ ప్రో-యాంజియోజెనిక్ దట్టమైన మైక్రోవాస్కులర్ నెట్‌వర్క్‌ను చూపించాయి, ఇది మొత్తం కణితి ద్వారా పంపిణీ చేయబడింది. ఆసక్తికరంగా, తిరస్కరణ దశలో (10 వ రోజు), Tlr - / - ఎలుకలలోని కణితులు మరింత భిన్నంగా వాస్కులరైజ్ చేయబడ్డాయి మరియు పెద్ద కణితి ప్రాంతాలు సాధారణ కణితి-అనుబంధ వాస్కులర్ నెట్‌వర్క్ (Fig. 3d, దిగువ ప్యానెల్లు) లేనివిగా కనిపించాయి. ఈ దృగ్విషయంలో ఎండోథెలియల్ సెల్ డెత్ పాల్గొనవచ్చో లేదో పరిశీలించడానికి, మేము సిడి 31 స్టెయినింగ్‌ను కాస్‌పేస్ స్టెయినింగ్‌తో కలిపాము. WT మరియు Tlr3 / 7/9 - / - ఎలుకల కణితుల్లో కాస్‌పేస్‌కు చాలా ఎండోథెలియల్ కణాలు ప్రతికూలంగా ఉన్నాయి, కణితి తిరస్కరణ సమయంలో గణనీయమైన ఎండోథెలియల్ కాస్‌పేస్-మధ్యవర్తిత్వ కణాల మరణం అసంభవం (Fig. 3e). స్థాపించబడిన పెరిసైట్ మార్కర్స్ డెస్మిన్ మరియు α- మృదువైన కండరాల ఆక్టిన్ 29 ను ఉపయోగించడం ద్వారా మేము రెండు కణితి రకాల్లో వాస్కులర్ పరిపక్వత స్థాయిని విశ్లేషించాము. Tlr - / - ఎలుకలలో కనిపించే మెరుగైన వాస్కులర్ వ్యాసానికి అనుగుణంగా, 14 వ రోజు Tlr - / - ఎలుకల ఇంట్రాట్యుమరల్ మైక్రోవేస్సెల్స్ డెస్మిన్-పాజిటివ్ కుడ్య కణాల బలమైన నియామకంతో మరియు నాళాల సాధారణీకరణ యొక్క సూచికతో పరిపక్వ వాస్కులర్ నెట్‌వర్క్‌ను ప్రదర్శించాయి. దీనికి విరుద్ధంగా, WT ఎలుకల కణితుల్లో పెర్సిసైట్ కవరేజ్ యొక్క మొత్తం నష్టం లేదా పాక్షిక లేకపోవడం గమనించబడింది (Fig. 3f). నౌక పరిపక్వత యొక్క పరిమాణం 10 వ రోజు (WT 52% డెస్మిన్ + నాళాలు; Tlr - / - 59% డెస్మిన్ + నాళాలు) వద్ద తేడా లేదని సూచించింది, కాని 14 వ రోజు (WT 36% వర్సెస్ Tlr - / - 91%) (Fig. 3g). ఈ డేటా Tlr - / - ఎలుకలలోని కణితి రిగ్రెషన్ నాళాల సాధారణీకరణతో కూడుకున్నదని , అయితే WT ఎలుకలలో కణితి పెరుగుదల ఒక సాధారణ కణితి-అనుబంధ ప్రో-యాంజియోజెనిక్ నాళాల సమలక్షణంతో ముడిపడి ఉందని ఈ డేటా నిర్ధారిస్తుంది.

Image

( a - c ) ఇంజెక్షన్ తర్వాత 6, 10 లేదా 14 వ రోజులలో విచ్ఛిన్నమైన sc కణితుల యొక్క ఘనీభవించిన విభాగాలు αCD31 యాంటీబాడీతో తడిసినవి, 8 నుండి 16 వారాల వయస్సు గల C57BL / 6 WT మరియు Tlr3 / 7/9 - / - ఎలుకలు. ( ) 10 వ రోజు కణితుల ప్రతినిధుల ఉదాహరణలు 14. స్కేల్ బార్, 100 μm. ( బి ) ఓడ వ్యాసం యొక్క విశ్లేషణ కోసం, నాళాలు man 200 మాగ్నిఫైడ్ చిత్రాలలో మానవీయంగా అంచనా వేయబడ్డాయి మరియు ఇమేజ్‌జే సాఫ్ట్‌వేర్ ( n = 3) ఉపయోగించి వ్యాసం కొలవబడింది. పి- విలువ ( టి -టెస్ట్) సూచించబడుతుంది (* పి 0.05). ఒకే విలువలు మరియు సగటు (క్షితిజ సమాంతర రేఖ) చూపబడతాయి. ( సి ) మాన్యువల్ అబ్జర్వర్ అసిస్టెడ్ లెక్కింపు ద్వారా నౌక సంఖ్య యొక్క పరిమాణాన్ని ఒక నమూనాకు నాలుగు × 200 మాగ్నిఫైడ్ యాదృచ్ఛికంగా ఎంచుకున్న చిత్రాలు ( n = 6–7) ద్వారా జరిగాయి. ఒకే విలువలు మరియు సగటు (క్షితిజ సమాంతర రేఖ) చూపబడతాయి. * P 0.05 ( t -test) వద్ద ఫలితాలు ముఖ్యమైనవిగా పరిగణించబడ్డాయి. ( డి ) పన్నెండు నుండి 16 వారాల వయస్సు గల C57BL / 6 WT మరియు Tlr3 / 7/9 - / - ఎలుకలు పెర్ఫ్యూజ్ చేయబడ్డాయి మరియు MOPC −eGFP కణితి కణాలు (ఆకుపచ్చ) ఇంజెక్షన్ చేసిన 10 రోజుల తరువాత sc కణితులను శస్త్రచికిత్స ద్వారా తొలగించారు. కణితిని తొలగించే ముందు, అలెక్సా ఫ్లోర్ 647-కపుల్డ్ α సిసి 31 యాంటీబాడీ (ఎరుపు) ఇంజెక్షన్ ద్వారా నాళాలు వివోలో తడిసినవి. కణితి కణజాలం లైట్ షీట్ మైక్రోస్కోపీ ద్వారా క్లియర్ చేయబడింది మరియు విశ్లేషించబడింది. ImageJ మరియు Imaris సాఫ్ట్‌వేర్ ఉపయోగించి త్రిమితీయ చిత్రాలు సృష్టించబడ్డాయి. WT మరియు TLR- లోపం ఉన్న ఎలుకల కణితులకు రెండు ప్రాతినిధ్య ఉదాహరణలు చూపించబడ్డాయి. స్కేల్ బార్, 600 μm. ( ) వివరించిన కణితుల యొక్క మూడు-రంగు ఇమ్యునోఫ్లోరోసెన్స్. 8 నుండి 16 వారాల వయస్సు గల C57BL / 6 WT మరియు Tlr3 / 7/9 - / - ఎలుకల నుండి d10 మరియు d14 కణితి విభాగాల యొక్క CD31 (నాళాలు) మరియు కాస్పేస్ 3 (సెల్ డెత్) యొక్క ప్రతినిధి ఉదాహరణ చూపబడింది. న్యూక్లియైస్‌ను దృశ్యమానం చేయడానికి డాపి (4, 6-డయామిడినో -2 ఫెనిలిండోల్; నీలం) ఉపయోగించబడింది. స్కేల్ బార్, 50 μm. ( ఎఫ్ ) నాళాల పెర్సైసైట్ మరక. 8 నుండి 16 వారాల వయస్సు గల C57BL / 6 WT మరియు Tlr3 / 7/9 - / - ఎలుకల నుండి d14 కణితి విభాగాల యొక్క CD31 (నాళాలు) మరియు డెస్మిన్ (పెరిసైట్లు) యొక్క ప్రతినిధి ఉదాహరణ చూపబడింది. కేంద్రకాలను దృశ్యమానం చేయడానికి డాపి (నీలం) ఉపయోగించబడింది. స్కేల్ బార్లు, 100 μm. ( జి ) 10 వ రోజు మరియు 14 వ రోజు n = 3 ఎలుకల నుండి డెస్మిన్-పాజిటివ్ నాళాలు కణితికి ఐదు క్షేత్రాల వరకు మాన్యువల్ లెక్కింపు ద్వారా లెక్కించబడ్డాయి, మొత్తం 100 నాళాలతో సహా, కణితికి మూడు కణితి విభాగం యొక్క సగటును ఉపయోగించి (పై, మధ్య మరియు బేస్) సమన్వయ దూరం. ఒకే విలువలు మరియు సగటు (క్షితిజ సమాంతర రేఖ) చూపబడతాయి. మూడు నక్షత్రాలు (***) గణాంక వ్యత్యాసం P 0.0005 ( t -test) ను సూచిస్తాయి.

పూర్తి పరిమాణ చిత్రం

TLR- లోపం ఉన్న ఎలుకలలో ఎర్రబడిన కణితి కణ సమలక్షణం

ఈ ఫలితాల ఆధారంగా, మైక్రోవాస్కులర్ ఎండోథెలియంలోని తేడాలు రోగనిరోధక కణాల ద్వారా కణితుల యొక్క అవకలన చొరబాటుతో మరింత సంబంధం కలిగి ఉంటాయని మేము ulated హించాము. WT ఎలుకలలోని కణితులు రోగనిరోధక కణాల ద్వారా మధ్యస్తంగా చొరబడి ఉన్నాయని మేము కనుగొన్నాము (Fig. 4a, b). Tlr - / - ఎలుకలు 6 వ రోజు పోస్ట్ ఇంజెక్షన్ వరకు ఇదే విధమైన మితమైన చొరబాట్లను చూపించాయి. 6 వ రోజు, అయితే, Tlr - / - ఎలుకలలో కణితి-అనుబంధ ల్యూకోసైట్ల సంఖ్య గణనీయంగా పెరిగింది. ఈ బలమైన ప్రేరిత రోగనిరోధక చొరబాటు మైలోయిడ్ (CD11b, Gr-1) మరియు లింఫోయిడ్ (CD4, CD8) కణాలతో కూడి ఉంది. ఆసక్తికరంగా, కణితి చొరబాటులో ఈ మార్పు పరిధీయ రక్త రోగనిరోధక కణ ఉపసమితుల కూర్పులో మార్పులతో కూడి లేదు (అనుబంధ Fig. 3a). Tlr - / - ఎలుకలలో కణితుల యొక్క తాపజనక పెరుగుదల కణితి కణజాలంలోకి రోగనిరోధక కణాల మెరుగైన మరియు చురుకైన వలసల వల్ల సంభవించిందో లేదో పరీక్షించడానికి, మేము దత్తత బదిలీ ప్రయోగాలు చేసాము. ఈ క్రమంలో, కణితిని మోసే WT మరియు Tlr - / - గ్రహీత ఎలుకలను కణితి-మోసే దాత ఎలుకల (WT మరియు Tlr - / - రెండూ) నుండి తీసుకోబడిన ఫ్లోరోసెంట్‌గా లేబుల్ చేయబడిన స్ప్లెనోసైట్‌లతో ఇంజెక్ట్ చేయబడ్డాయి. ఒక రోజు తరువాత, కణితులను వివరించడం, క్లియర్ చేయడం మరియు 3 డి లైట్ షీట్ మైక్రోస్కోపీకి గురిచేయడం జరిగింది. అనుబంధ Fig. 3b లో చూపినట్లుగా, గణనీయమైన సంఖ్యలో కణితి-చొరబాటు స్ప్లెనోసైట్లు Tlr - / - ఎలుకలలో మాత్రమే గుర్తించబడతాయి, ఇవి TLR- లోపం ఉన్న ఎలుకల నుండి దత్తత బదిలీ చేయబడిన కణాలను అందుకున్నాయి. ఈ డేటా, BM చిమెరా ప్రయోగం (Fig. 2) తో ఒప్పందంలో, TLR- లోపం ఉన్న ఎలుకలలో తాపజనక రోగనిరోధక కణాల నియామకానికి హేమాటోపోయిటిక్ స్ట్రోమా మరియు రోగనిరోధక కణాల మధ్య సహకార విధానాలు కారణమని సూచిస్తున్నాయి.

Image

( ) 8- నుండి 16 వారాల వయస్సు గల C57BL / 6 WT మరియు Tlr3 / 7/9 - / - యొక్క స్తంభింపచేసిన కణితి విభాగాల ఇమ్యునోహిస్టోకెమికల్ మరకను వేర్వేరు సమయ బిందువులలో కణితి-చొరబాటు రోగనిరోధక కణాల పౌన frequency పున్యాన్ని అంచనా వేయడానికి ప్రదర్శించారు (రోజు 1, 3 వ రోజు, 6 వ రోజు, 10 వ రోజు మరియు 14 వ రోజు). సానుకూల కణాల సంఖ్య యొక్క పరిమాణాన్ని పరిశీలకుడి-సహాయక లెక్కింపు ద్వారా నాలుగు యాదృచ్చికంగా ఎంచుకున్న × 200 మాగ్నిఫైడ్ చిత్రాలకు ప్రతి నమూనాకు ( n = 3–7) ప్రదర్శించారు. ఒకే విలువలు మరియు సగటు (క్షితిజ సమాంతర రేఖ) చూపబడతాయి. ( బి ) ఇంజెక్షన్ చేసిన 14 రోజుల తరువాత కణితుల యొక్క ఇమ్యునోహిస్టోకెమికల్ మరక యొక్క ప్రతినిధి ఉదాహరణలు. స్కేల్ బార్, 100 μm. ( సి ) జన్యు వ్యక్తీకరణ యొక్క క్రమానుగత క్లస్టరింగ్: 2 × 10 6 MOPC కణితి కణాలు 8 నుండి 16 వారాల వయస్సు గల C57BL / 6 WT మరియు Tlr3 / 7/9 - / - ఎలుకలలోకి చొప్పించబడ్డాయి మరియు 6 రోజుల తరువాత కణితులు విచ్ఛిన్నమయ్యాయి. . RNA వేరుచేయబడింది మరియు అఫిమెట్రిక్స్ చిప్ ( n = 2) ఉపయోగించి మైక్రోఅరే విశ్లేషణ జరిగింది. వేర్వేరు సైటోకిన్‌ల సిగ్నల్ తీవ్రత క్రమానుగత క్లస్టరింగ్‌గా చూపబడుతుంది. ఎరుపు జన్యు వ్యక్తీకరణ యొక్క నియంత్రణను సూచిస్తుంది; తెలుపు జన్యు నియంత్రణ లేదని సూచిస్తుంది. ( డి ) పరిమాణాత్మక పిసిఆర్ ద్వారా ఎంచుకున్న సైటోకిన్‌ల యొక్క జన్యు వ్యక్తీకరణ సమయ కోర్సులో విశ్లేషించబడింది: రోజు 0 (చర్మం మాత్రమే), 4 వ రోజు, 6 వ రోజు మరియు 10 వ రోజు ( n = 3 ఎలుకలు). Tlr3 / 7/9 - / - ఎలుకల కణితుల కోసం రోజు 0 వరకు సాపేక్ష వ్యక్తీకరణ యొక్క సగటు చూపబడుతుంది. ( ) 10 వారాల వయస్సు గల C57BL / 6 WT మరియు Tlr3 / 7/9 - / - లోకి sc కణితి కణ ఇంజెక్షన్ చేసిన తరువాత 10 వ రోజు కణితులు వివరించబడ్డాయి మరియు 2 రోజులు మీడియంలో (20 mg ml −1 ) కల్చర్ చేయబడ్డాయి . SN లలో IL-6, IFN-γ ( n = 6) మరియు IL-24 ( n = 9) యొక్క ఏకాగ్రత విశ్లేషించబడింది. ఒకే విలువలు మరియు సగటు (క్షితిజ సమాంతర రేఖ) చూపబడతాయి. * P 0.05, ** P 0.005 మరియు *** P 0.0005 ( t -test) వద్ద ఫలితాలు ముఖ్యమైనవిగా పరిగణించబడ్డాయి.

పూర్తి పరిమాణ చిత్రం

Tlr - / - ఎలుకల కణితుల్లో ఈ తాపజనక చర్యను బాగా అర్థం చేసుకునే ప్రయత్నంలో, మేము పైలట్ ప్రయోగం (నాలుగు ఎలుకలు, 6 వ రోజు) చేసాము మరియు RNA మైక్రోరేలను ఉపయోగించి కణితి కణజాలంలో జన్యు వ్యక్తీకరణను విశ్లేషించాము. సైటోకిన్ జన్యు వ్యక్తీకరణ యొక్క మూల్యాంకనం WT జంతువులపై KO లో ఇంటర్‌లుకిన్ (IL) -6, IL-24 మరియు ఇంటర్ఫెరాన్ (IFN) -γ యొక్క ప్రేరణను సూచించింది (Fig. 4c). ఈ అభ్యర్థి జన్యువులను సమయ కోర్సులో మరియు ప్రోటీన్ స్థాయిలో (Fig. 4d, e) మరింత పరిశోధించారు. మునుపటి ఫలితాలతో ఒప్పందంలో, IL-6 మరియు IL-24 యొక్క ప్రేరణ 4 వ రోజు మరియు 6 వ రోజు మధ్య ప్రారంభమైంది, తరువాత IFN-of యొక్క ప్రేరణ వచ్చింది. మాజీ వివో కల్చర్డ్ ట్యూమర్ వివరణల నమూనాను ఉపయోగించి ప్రోటీన్ స్థాయిలో IFN-γ మరియు IL-6 విడుదల కూడా నిర్ధారించబడింది (Fig. 4e). IL-24 యొక్క ఇండక్షన్ RNA స్థాయికి పరిమితం చేయబడినట్లు అనిపించింది మరియు ట్యూమర్ ఎక్స్‌ప్లెంట్ సూపర్‌నాటెంట్స్ (SN లు) యొక్క ఎంజైమ్-లింక్డ్ ఇమ్యునోసోర్బెంట్ అస్సే (ELISA) విశ్లేషణ ద్వారా నిర్ధారించబడలేదు.

TLR- లోపం ఉన్న ఎలుకలలో T- సెల్-ఆధారిత కణితి తిరస్కరణ

తదుపరి శ్రేణి ప్రయోగాలలో, WT వర్సెస్ Tlr - / - ఎలుకలలో T కణాల క్రియాశీలత స్థితి, సమలక్షణం మరియు కార్యాచరణను మేము అన్వేషించాము. కణితి-ఎండిపోయే శోషరస కణుపుల నుండి CD4 మరియు CD8 T కణాల యొక్క విస్తరణ చర్య WT నియంత్రణలతో పోలిస్తే TLR- లోపం ఉన్న ఎలుకలలో ఎక్కువగా ఉంది (Fig. 5a). కణితుల్లో, > TLR- లోపం ఉన్న ఎలుకలలోని 40% CD4 కణాలు CD62L - / CD154 + (Fig. 5b) గా నిర్వచించబడిన సక్రియం చేయబడిన సమలక్షణాన్ని ప్రదర్శించాయి. అదేవిధంగా, సైటోటాక్సిక్ సిడి 8 టి కణాల శాతం (గ్రాంజైమ్ బి, సిడి 107 ఎ లేదా పెర్పిన్‌కు అనుకూలమైనది) టిఎల్‌ఆర్-లోపం ఉన్న ఎలుకలలో డబ్ల్యూటి ఎలుకలపై బలంగా ప్రేరేపించబడింది (Fig. 5 బి మరియు అనుబంధ Fig. 3d). ఈ ఫలితాలకు అనుగుణంగా, TLR - / - యొక్క కణితుల నుండి గణనీయమైన సంఖ్యలో CD4 మరియు CD8 కణాలు, కానీ WT ఎలుకల నుండి కాదు, స్వల్పకాలిక మాజీ వివోకు ప్రతిస్పందనగా IFN-γ మరియు ట్యూమర్ నెక్రోసిస్ ఫ్యాక్టర్ (TNF) -α ను కూడా స్రవిస్తాయి. ఉద్దీపన (Fig. 5 సి). యాక్టివేషన్ మార్కర్స్ మరియు సైటోటాక్సిక్ అణువులతో పాటు, ఎగ్జాషన్ మార్కర్స్ యొక్క వ్యక్తీకరణ మరియు ఇంట్రాటుమౌరల్ రెగ్యులేటరీ టి కణాల ఫ్రీక్వెన్సీని కూడా మేము పరీక్షించాము. PD-1, LAG3 మరియు Tim3 వంటి అలసట యొక్క సంభావ్య గుర్తులు రెండు మౌస్ జాతుల మధ్య భేదాత్మకంగా వ్యక్తపరచబడనప్పటికీ, ఫాక్స్ పి 3 + రెగ్యులేటరీ టి కణాల శాతం 10 వ రోజు KO ఎలుకలపై WT ఎలుకలలో పెరిగింది (అనుబంధ Fig. 3c).

Image

( ) శోషరస కణుపులు: 6 నుండి 12 వారాల వయస్సు గల C57BL / 6 WT మరియు Tlr3 / 7/9 - / - యొక్క కణితి-ఎండిపోయే శోషరస కణుపులలో (LN లు) విస్తరించే కణాల సంఖ్య 6 మరియు రోజు రోజులలో అంచనా వేయబడింది 10 αCD4 మరియు αKi67 ప్రతిరోధకాలను ఉపయోగించి స్తంభింపచేసిన విభాగాల ఇమ్యునోఫ్లోరోసెన్స్ డబుల్ మరక ద్వారా. సానుకూల కణాల పరిమాణాన్ని పరిశీలకుడి-సహాయక లెక్కింపు ద్వారా నాలుగు యాదృచ్ఛికంగా ఎంచుకున్న × 200 మాగ్నిఫైడ్ చిత్రాలకు ప్రతి నమూనా ( n = 3) ద్వారా ప్రదర్శించారు. ( బి, సి ) కణితి: 6 నుండి 12 వారాల వయస్సు గల C57BL / 6 WT మరియు Tlr3 / 7/9 - / - 6 మరియు 10 వ రోజు ఎలుకల కణితి-చొరబాటు లింఫోసైట్‌ల యొక్క టి-సెల్ యాక్టివేషన్ యొక్క ఫ్లో సైటోమెట్రిక్ విశ్లేషణ. ( బి ) CD62L - / CD154 + కణాల మరక ద్వారా CD4 + కణాల క్రియాశీలత స్థితిని విశ్లేషించారు. గ్రాన్జైమ్ B + (GzmB) మరియు CD107a + వ్యక్తీకరణను చూపించడం ద్వారా సక్రియం చేయబడిన CD8 + కణాలు నిర్ణయించబడతాయి. ( సి ) αCD3 / CD28 ప్రతిరోధకాలతో ఎక్స్ వివో స్టిమ్యులేషన్ మరియు αIFN-γ మరియు αTNF-α ప్రతిరోధకాలను ఉపయోగించి తదుపరి ఫ్లో సైటోమెట్రీ మరక తరువాత కణితి-చొరబాటు CD4 + మరియు CD8 + కణాల సైటోకిన్ ఉత్పత్తిని అంచనా వేశారు. ఒకే విలువలు మరియు సగటు (క్షితిజ సమాంతర రేఖ) చూపబడతాయి. * P 0.05 మరియు ** P 0.005 ( t -test) వద్ద ఫలితాలు ముఖ్యమైనవిగా పరిగణించబడ్డాయి.

పూర్తి పరిమాణ చిత్రం

కలిపి, ఈ డేటా కణితి-ఎండిపోయే శోషరస కణుపులలో పెరిగిన విస్తరణ చర్యను మరియు TLR- లోపం ఉన్న ఎలుకల కణితి సూక్ష్మ వాతావరణంలో పెరిగిన టి-సెల్ కార్యకలాపాలను సూచిస్తుంది. ఆసక్తికరంగా, ఈ తేడాలు 10 వ రోజున గమనించబడ్డాయి, కానీ 6 వ రోజు కాదు, అందువలన కణితి యొక్క స్థూల తిరస్కరణతో సమానంగా ఉంటుంది.

Tlr - / - ఎలుకలలోని IFN-γ మరియు సైటోటాక్సిక్ అణువుల యొక్క ప్రధాన ప్రేరణతో T కణాల యొక్క బలమైన ప్రవాహం క్షీణత ప్రయోగాలలో కణితి తిరస్కరణ కోసం CD4 మరియు CD8 కణాల v చిత్యాన్ని పరీక్షించడానికి మనల్ని ప్రేరేపించింది. సంభావ్య యాంటీ-ట్యూమర్ టి కణాలు CD11b + / Gr-1 + రెగ్యులేటరీ మైలోయిడ్ కణాల నియంత్రణలో ఉండవచ్చని మేము భావించాము మరియు మా ప్రయోగాత్మక రూపకల్పనలో Gr-1 క్షీణతను చేర్చాము. WT ఎలుకలలో, ఐసోటైప్ కంట్రోల్-ట్రీట్డ్, సిడి 4-డిప్లీటెడ్ మరియు సిడి 8-డిప్లెటెడ్ ఎలుకలలో కణితుల పెరుగుదల గణనీయంగా తేడా లేదు. అయినప్పటికీ, కొద్దిగా మరియు గణాంకపరంగా ముఖ్యమైనది (* P 0.05 మరియు ** P 0.005, t -test), వేగవంతమైన కణితి పెరుగుదల ముఖ్యంగా CD4- క్షీణించిన జంతువులలో గుర్తించబడింది (Fig. 6a). దీనికి విరుద్ధంగా, Tlr - / - ఎలుకలలోని రెండు T- సెల్ ఉపసమితుల క్షీణత TLR- సమర్థ WT నియంత్రణ ఎలుకలను పోలి ఉండే కణితి పెరుగుదల వక్రతలతో కణితి తిరస్కరణను పురోగతిగా మార్చింది. ఈ డేటా TLR3 / 7/9 లేనప్పుడు కణితి తిరస్కరణ CD4 మరియు CD8 T కణాల రెండింటిపై ఆధారపడి ఉంటుందని స్పష్టంగా నిర్ధారిస్తుంది. మైలోయిడ్ కణాలు బదులుగా కణితి తిరస్కరణను మార్చవు, ఎందుకంటే టిఎల్ఆర్ - / - తిరస్కరించబడిన కణితులు Gr-1 క్షీణత సమయంలో నాలుగు కేసులలో మూడింటిలో (Fig. 6b).

Image

( ) సిడి 4 మరియు సిడి 8 లకు వ్యతిరేకంగా ప్రతిరోధకాలను తగ్గించడం 12 నుండి 17 వారాల వయస్సు గల C57BL / 6 WT మరియు Tlr3 / 7/9 - / - ఎలుకలలోకి ప్రవేశపెట్టబడింది. నియంత్రణ ఎలుకలను తగిన ఐసోటైప్‌తో చికిత్స చేశారు. కణితి పెరుగుదల ప్రతిరోజూ కొలుస్తారు. సమూహానికి నాలుగు నుండి ఎనిమిది ఎలుకల సగటు. * P 0.05 మరియు ** P 0.005 ( t -test) వద్ద ఫలితాలు ముఖ్యమైనవిగా పరిగణించబడ్డాయి. ( బి ) మైలోయిడ్ రెగ్యులేటరీ కణాలను క్షీణించడానికి, 11 నుండి 17 వారాల వయస్సు గల C57BL / 6 Tlr3 / 7/9 - / - ఎలుకలను αGr-1 యాంటీబాడీతో కణితి కణ ఇంజెక్షన్ ముందు ప్రారంభించి మొత్తం ప్రయోగంలో కొనసాగించారు ( n = 4). నియంత్రణ సమూహాన్ని ఐసోటైప్ యాంటీబాడీస్ ( n = 2) తో చికిత్స చేశారు. ఫ్లో సైటోమెట్రీని ఉపయోగించి పరిధీయ రక్తంలో క్షీణతను పరిశీలించారు మరియు ఇది ఆకుపచ్చ గీత ద్వారా సూచించబడుతుంది. రెండింటిలో ఒక ప్రతినిధి ప్రయోగం చూపబడింది. ( సి ) Tlr3 / 7/9 - / - ఎలుకల ( Tlr3 / 7/9 - / - రిగ్రెజర్, నీలం) కుడి పార్శ్వంలోకి కణితి కణాలు (0.5 × 10 6 ) ఇంజెక్ట్ చేయబడ్డాయి. కణితి తిరస్కరణ (ఎరుపు బాణం) తరువాత, అదే ఎలుకలను అదే సంఖ్యలో కణితి కణాలతో వ్యతిరేక పార్శ్వంలో ఇంజెక్ట్ చేశారు. అమాయక Tlr3 / 7/9 - / - (బూడిద) మరియు C57BL / 6 WT ఎలుకలు (నలుపు) కూడా ఇంజెక్ట్ చేయబడ్డాయి మరియు నియంత్రణలుగా పనిచేశాయి. రీఛాలెంజ్ సమయంలో, ఎలుకలు 24–26 వారాల వయస్సులో ఉన్నాయి. కణితి పరిమాణాన్ని ప్రతి ఇతర రోజు కొలుస్తారు. సగటు కణితి వాల్యూమ్ group సెమ్‌కు మూడు నుండి ఐదు ఎలుకలు చూపబడతాయి.

పూర్తి పరిమాణ చిత్రం

మా అధ్యయనం యొక్క చివరి భాగంలో, టి-సెల్-ఆధారిత కణితి తిరస్కరణ క్లాసికల్ మెమరీ ప్రతిస్పందనకు దారితీస్తుందా అని మేము అడిగారు. ఈ విషయాన్ని పరిష్కరించడానికి, మేము రీ-ఛాలెంజ్ ప్రయోగం చేసాము (Fig. 6c). Tlr - / - ఎలుకలను MOPC కణితులతో ఇంజెక్ట్ చేసి, కణితిని తిరస్కరించడానికి అనుమతించారు (అత్తి 6C లోని నీలి చతురస్రాలు). తిరస్కరణ తరువాత, అదే సంఖ్యలో కణితి కణాలు రిగ్రెసర్ ఎలుకల వ్యతిరేక పార్శ్వంలోకి చొప్పించబడ్డాయి (అత్తి 6 లో బాణం). ఈ సమయంలో, అమాయక WT మరియు అదనపు TLR- లోపం ఉన్న ఎలుకలను కూడా కణితి కణాలు (బాణం) తో ఇంజెక్ట్ చేసి నియంత్రణలుగా పనిచేశారు. Expected హించినట్లుగా, WT ఎలుకలు ప్రగతిశీల కణితి పెరుగుదలను (బ్లాక్ సర్కిల్స్) చూపించగా, కణితి-అమాయక TLR- లోపం ఉన్న ఎలుకలు (బూడిద త్రిభుజాలు) కణితి తిరస్కరణను చూపించాయి-కణితి కణ ఇంజెక్షన్ తర్వాత 10 రోజుల తరువాత. TLR- లోపం ఉన్న ఎలుకలలో కణితి పెరుగుదల గమనించబడలేదు, ఇది గతంలో కణితిని (నీలి చతురస్రాలు) తిరస్కరించింది, ఇది యాంటీ-ట్యూమర్ మెమరీ ప్రతిస్పందన యొక్క ప్రేరణను ప్రదర్శిస్తుంది. సమిష్టిగా, మా ప్రయోగాలు TLR3 / 7/9-లోపం ఉన్న ఎలుకల రక్షిత T- సెల్-ఆధారిత రోగనిరోధక శక్తిని ప్రేరేపించడానికి బహిర్గతం చేస్తాయి, ఇది కణితి సూక్ష్మ పర్యావరణం, T- సెల్ క్రియాశీలత మరియు కణితి రిగ్రెషన్‌లో గణనీయమైన మార్పులతో సంబంధం కలిగి ఉంటుంది.

చర్చా

TLR లు వ్యాధికారక-అనుబంధ పరమాణు నమూనాల యొక్క ముఖ్యమైన సెన్సార్లు మరియు విదేశీ చొరబాటుదారుల నుండి హోస్ట్‌ను రక్షించడానికి సహాయపడతాయి. TLR ల యొక్క నిశ్చితార్థం అనుకూల రోగనిరోధక శక్తితో అంతర్లీనంగా ఉంటుంది మరియు రక్షిత రోగనిరోధక శక్తిని ప్రేరేపిస్తుంది. ఈ సూత్రం తరువాత చికిత్సా పద్ధతిలో ఉపయోగించబడింది మరియు దోపిడీ చేయబడింది, నేటి క్యాన్సర్ ఇమ్యునోథెరపీలో టిఎల్ఆర్ అగోనిస్ట్‌లు ముఖ్యమైన భాగాలుగా మారాయి. దీనికి విరుద్ధంగా, మరియు కొంతవరకు ప్రతికూలంగా, కొన్ని సందర్భాల్లో ఎండోజెనస్ లిగాండ్ల ద్వారా టిఎల్‌ఆర్‌లను ప్రేరేపించడం వల్ల యాంటీ-ట్యూమర్ రోగనిరోధక శక్తి ఏర్పడదు, కానీ కణితి పురోగతికి దోహదం చేస్తుంది. ఈ సందర్భాలలో టిఎల్ఆర్ యాక్టివేషన్ అనేది నిరంతర మరియు దీర్ఘకాలిక ప్రక్రియ, ఇది కణితిని ప్రేరేపించే వ్యాధికారక కారకాలు 30, 31 లేదా క్యాన్సర్ సంబంధిత మంట 32 సమయంలో విడుదలయ్యే ఎండోజెనస్ టిఎల్ఆర్ లిగాండ్ల ద్వారా ప్రేరేపించబడుతుంది. ఇటీవల, ఎండోజెనస్ మరియు థెరపీ-ప్రేరిత యాంటీ-ట్యూమర్ రోగనిరోధక ప్రతిస్పందనలతో మైక్రోబయోమ్ అని పిలవబడే పరస్పర సంబంధం ఎక్కువగా దృష్టిని ఆకర్షించింది. మురిన్ మెలనోమా మోడళ్లను ఉపయోగించి ఒక మార్గదర్శక కాగితంలో, శివన్ మరియు ఇతరులు . మెరుగైన ఎండోజెనస్ యాంటీ-ట్యూమర్ రోగనిరోధక శక్తితో సంబంధం కలిగి ఉన్న చెక్ పాయింట్-బ్లాకేడ్ ఇమ్యునోథెరపీతో సినర్జైజ్ చేయబడిన విలక్షణమైన ప్రారంభ మైక్రోబయోటాను గుర్తించారు. చికిత్స-ప్రేరిత యాంటీ-ట్యూమర్ రోగనిరోధక శక్తి యొక్క నమూనాలో, ప్రారంభ మైక్రోబయోటా మరియు మైలోయిడ్ కణాల పరస్పర చర్య ఇమ్యునో- మరియు కెమోథెరపీ 35 కు ప్రతిస్పందనను ప్రభావితం చేసింది. మొత్తం మీద, ఈ డేటా TLR సిగ్నలింగ్ మరియు యాంటీ-ట్యూమర్ రోగనిరోధక శక్తి యొక్క సంక్లిష్టమైన మరియు అత్యంత సందర్భ-ఆధారిత ఇంటర్ కనెక్షన్‌ను హైలైట్ చేస్తుంది.

కణితి కణాలు మరియు కణితి హోస్ట్ యొక్క ప్రాణాంతక కణాలు రెండూ TLR లిగాండ్లకు లక్ష్యంగా ఉంటాయి. కణితి కణాలలో టిఎల్ఆర్ ప్రతిస్పందనలను ప్రేరేపించడం కణితి కణ మరణం 7 యొక్క ప్రేరణకు దారితీస్తుందని వివరించబడింది, ఇది కొన్ని పరిస్థితులలో, ఇమ్యునోజెనిక్ లేదా ఇమ్యునోస్టిమ్యులేటరీ సెల్ డెత్ 10 గా సూచించే యంత్రాంగాల ద్వారా యాంటీ-ట్యూమర్ రోగనిరోధక శక్తిని ప్రేరేపించడంతో సంబంధం కలిగి ఉంటుంది. Alternatively, activation of TLR on tumour cells can also promote tumour growth by inducing anti-apoptotic mechanisms, immune escape or chemoresistance 8, 36 .

In this study, we specifically focused on the role of the endosomal TLRs 3, 7 and 9 expressed on non-malignant host cells. To this end, we used transplantable WT tumour cell lines and TLR-deficient host mice. We show that the absence of those TLRs on host cells results in the induction of protective CD8 T-cell-mediated immunity and complete regression of WT tumour cells in multiple tumour models. Tumour regression required the cooperative activity of immune and radioresistant host cells. The anti-tumour immune response was associated with significant alterations in the tumour microenvironment such as vessel normalization, enhanced numbers and strong activation of tumour-infiltrating lymphocytes.

Until today, endogenous triggering of TLRs on host cells has been studied mainly for TLR2 and 4, whereas less is known on the endosomal TLRs 3, 7 and 9. This is partly due to the fact that the endogenous ligands, commonly referred to as DAMPs, for TLR2/4 are by far better characterized than their endosomal nucleic-acid-sensing counterparts. Examples for TLR2/4 DAMPs include HMGB1, histones, syndecans, heat-shock proteins and S100 proteins 37 . Interestingly, effects of TLR2 and TLR4 activation by those endogenous DAMPs seem to be context-dependent as well. In a transplantable model of orthotopic head and neck cancer in C3H mice, the absence of TLR4 on host cells resulted in accelerated tumour growth 28 . In the context of chemo- or radiotherapy, the expression of TLR4 and activation of MyD88 mainly on dendritic cells were crucial for efficient induction of anti-tumour immunity 20 . Conversely, in models of melanoma and bladder cancer, TLR4 signalling, supposedly via tumour-derived heat-shock proteins and tumour-associated macrophages, accelerated the growth of lung metastases 38 . Similarly, tumour-derived versican has been proposed as a driver of metastasis by promoting the pro-metastatic activity of myeloid cells via TLR2 (ref. 39). In contrast, the activation of TLR2 by HMGB1 during brain tumour therapy was reported to contribute to anti-tumour immunity via activation of dendritic cells 21 .

Unfortunately, and in contrast to TLR2/4, the endogenous ligands for TLR3/7/9 remain largely enigmatic. Some studies suggest that (mitochondrial) DNA, mostly in the context of severe injury and sepsis, could be implicated in pathological activation primarily of TLR9 (ref. 37). In addition, HMGB1 has been suggested as a DAMP for TLR9 (ref. 40), although it is difficult to determine whether HMGB1 or associated DNA is the recognized molecular structure 40, 41 . In most of the studies mentioned above, single TLR-KO, mostly for TLR2 and TLR4, have been used and some studies were indeed able to identify a major DAMP, which modulates tumour growth in the models tested. There are two fundamental differences between those studies and ours. At first, in our study single and even double KO mice did not show tumour regression. Regression was only observed in the combined TLR3/7/9 triple KO. This could point to a complex interaction of potential TLR ligands or the simultaneous activity of multiple ligands in our system. Alternatively, compensatory mechanisms of nucleic-acid-sensing TLRs could be in place, which mask the potential phenotype of single TLR-KO mice. Second, and even more importantly, we demonstrate not only quantitative modulation of tumour growth/progression but rather complete regression in the absence of TLR3, 7 and 9. To the best of our knowledge, such an effect on tumour growth in the absence of TLRs has not been demonstrated previously. Thus, our data suggest that a comprehensive deficiency in the endosomal nucleic-acid-sensing system of the host is required and sufficient to induce complete T-cell-mediated tumour regression and induction of protective memory.

We tried to determine whether TLR deficiency on haematopoietic or non-haematopoietic radioresistant host cells was required for induction of tumour regression. Unexpectedly, only the combined deficiency of both compartments resulted in induction of anti-tumour immunity. This was somewhat surprising, as previous papers suggested a predominance of the haematopoietic cells in TLR-dependent modulation of tumour growth. In a key study demonstrating the TLR-dependent pro-tumorigenic activity of haematopoietic cells of the host, Kim et al . 39 identified the inflammatory versican-TLR2-macrophage axis as a driver of metastasis. In a model of wound-induced skin cancer, the absence of TLR5 on leukocytes reduced tumour prevalence in BM chimeras 42 . Similarly, the absence of TLR7 on BM-derived cells reduced carcinogenesis in a pancreatic cancer model 43 . Conversely, implanted prostate cancer cells grew faster in Tlr3 −/− mice, although the relative contribution of BM-derived versus radioresistant cells or immune versus non-immune cells was not assessed in that study 44 .

In our study, tumours in WT mice were mostly non-inflamed, with low numbers of tumour-infiltrating T cells, which showed little activation. In TLR-deficient tumour regressor mice, we observed clear signs of T-cell activation in both lymph nodes and tumours. This activation was accompanied by strongly enhanced numbers of T cells infiltrating tumours from TLR-deficient mice. In addition to T-cell activation itself, T-cell recruitment to the tumour tissue and anti-tumour immunity may also be influenced by vessels and stromal fibroblasts. Although the role of the so-called cancer-associated fibroblasts in tumour progression and modulation of tumour immunity is fairly well established 45, 46, the influence of endothelial cells and especially pericytes on effector cell recruitment to the tumour is only beginning to emerge 47 . In an interesting study by Johansson et al . 48 TNF-α and IFN-γ were targeted to the tumour vasculature. Although IFN-γ primarily had anti-vascular pro-apoptotic activity, low-dose TNF-α stabilized the tumour-associated vascular network and enhanced CD8 effector T-cell activity. During the phase of tumour regression, we observed altered vessel structure and increased pericyte coverage, which could indicate a potential role of the altered vasculature in enhanced recruitment of effector T cells into the tumour microenvironment. However, initial experiments performed in this model did not suggest induced vessel activation or altered vascular permeability and leakiness in TLR-deficient mice. Thus, at this stage it remains unclear whether vascular alterations and enhanced T-cell influx are mechanistically linked or represent rather independent parallel events. It is also important to note that changes in vessel structure, T-cell influx, T-cell activation and tumour regression seem to be rather parallel events in this model. All of these were observed around day 10, but were not yet present at day 6 after tumour injection.

In clinical studies and human cancer patients, mostly expression of TLR on tumour cells has been analysed and evaluated for prognostic impact and clinical relevance. Few studies investigated TLR expression on stromal cells. For example, in an observational clinical study, TLR9 on stromal fibroblasts predicted enhanced survival in breast cancer 16 . Similarly, high expression of TLR7 on stromal fibroblasts was associated with good prognosis in oral squamous cell carcinoma (OSCC) 49 . Conversely, expression of TLR4 on stromal fibroblasts was associated with poor prognosis in colorectal cancer 14 . Similar data were reported for hepatocellular carcinoma, where TLR9 expression on tumour-associated fibroblasts was associated with reduced overall survival 50 . Thus, our study is one of the first to experimentally demonstrate a role for radioresistant (stromal) cells in regulation of tumour progression via endosomal TLR signalling.

Collectively, our data uncover a novel function of endosomal nucleic-acid-sensing TLRs for the regulation of anti-tumour immune responses. The combined absence of three TLRs on both BM-derived and radioresistant cells of the tumour host was required for tumour regression. Our data also suggest a previously unknown role for endosomal TLRs in limiting endogenous adaptive and protective T-cell responses in the tumour host.

పద్ధతులు

జంతువులు

All animal experiments were approved by the animal ethics committee of the state of North Rhine-Westphalia and carried out according to German guidelines for experimental animal welfare. Six- to 17-week-old male and female C57BL/6J WT and Tlr3/7/9 −/− were obtained from the animal facility of the University Hospital Essen or from Harlan Winkelmann GmbH (Borchen, Germany) and housed under standard conditions in individually ventilated cage racks. Six- to 12-week-old male and female Tlr single and Tlr double KO mice were provided by Stefan Bauer, Philipps-University Marburg.

Tumour cell culture

మురిన్ ఓరోఫారింజియల్ సెల్ లైన్లు (MOPC లు) జె. లీ (శాన్ఫోర్డ్ రీసెర్చ్ / యూనివర్శిటీ ఆఫ్ సౌత్ డకోటా) చేత అందించబడ్డాయి మరియు DMEM హై గ్లూకోజ్ మరియు హామ్స్ ఎఫ్ 12 (3: 1) (థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్, కార్ల్స్రూ, జర్మనీ) కలిగి ఉన్న మాధ్యమంలో కల్చర్ చేయబడ్డాయి. 10% (v / v) వేడి-నిష్క్రియం చేయబడిన FCS (బయోక్రోమ్, బెర్లిన్, జర్మనీ), 100 IU ml −1 పెన్సిలిన్, 100 μg ml −1 స్ట్రెప్టోమైసిన్ (థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్), ఎపిడెర్మల్ గ్రోత్ ఫ్యాక్టర్ (5 μg ml −1 ) ( బయోక్రోమ్), ఇన్సులిన్ (5 μg ml −1 ), ట్రాన్స్‌ఫ్రిన్ (5 μg ml −1 ), కలరా టాక్సిన్ (0.0084 mlg ml −1 ), హైడ్రోకార్టిసోన్ (0.5 μg ml −1 ) మరియు ట్రై-అయోడో-థైరోనిన్ (0.00136 mlg ml - 1 ) (సిగ్మా-అల్డ్రిచ్, టౌఫ్కిర్చేన్, జర్మనీ) 51 . MOPC −eGFP కణాలు pCL6IEGwo ఖాళీ వెక్టర్ 52 ను ఉపయోగించి లెంటివైరల్ జన్యు బదిలీ ద్వారా ఉత్పత్తి చేయబడ్డాయి మరియు FACS విశ్లేషణ ద్వారా> 90% మెరుగైన గ్రీన్ ఫ్లోరోసెంట్ ప్రోటీన్ (eGFP) పాజిటివిటీకి సమృద్ధిగా ఉన్నాయి. మురిన్ lung పిరితిత్తుల కార్సినోమా సెల్ లైన్ టిసి 1 ను జెడ్. ఫ్రిడ్లెండర్ (హడస్సా మెడికల్ సెంటర్, ఇజ్రాయెల్) మరియు మురైన్ మూత్రాశయ క్యాన్సర్ సెల్ లైన్ ఎంబి 49 కె. రెండు సెల్ లైన్లు DMEM హై గ్లూకోజ్‌లో 10% (v / v) FCS, 100 IU ml −1 పెన్సిలిన్, 100 μg ml −1 స్ట్రెప్టోమైసిన్ మరియు 1 mM సోడియం పైరువాట్ (థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్) తో భర్తీ చేయబడ్డాయి. వెనర్ మైకోప్లాస్మా డిటెక్షన్ కిట్ (మినర్వా బయోలాబ్స్, బెర్లిన్, జర్మనీ) ఉపయోగించి మైకోప్లాస్మా కాలుష్యం కోసం అన్ని కణాలు మామూలుగా పరీక్షించబడ్డాయి.

కణితి నమూనాలు

సింజెనిక్ మురిన్ సెల్ లైన్లు పార్శ్వంలోకి లేదా మస్క్యులస్ మైలోహాయిడస్ (ఆర్థోటోపిక్ ఇంజెక్షన్) లోకి ఇంజెక్ట్ చేయబడ్డాయి. అనస్థీషియా కింద 27-గేజ్ సిరంజిని ఉపయోగించి కణితి కణాలు (0.5 × 10 6 –2 × 10 6 ) పిబిఎస్‌లో వర్తించబడ్డాయి. Sc ఇంజెక్షన్ తరువాత, కణితి వాల్యూమ్ ప్రతిరోజూ రెండు కోణాలలో కొలుస్తారు మరియు కణితి వాల్యూమ్ క్రింది సూత్రం ప్రకారం అంచనా వేయబడుతుంది

Image

ఆర్థోటోపిక్ ఇంజెక్షన్ తరువాత, ఎలుకల బరువును ప్రతిరోజూ కొలుస్తారు. జంతు సంక్షేమ మార్గదర్శకాల ప్రకారం> 20% బరువు తగ్గిన తరువాత ఎలుకలు చనిపోయాయి.

ప్రాధమిక ప్లీహ కణాలు మరియు BM కణాల వేరుచేయడం

స్ప్లెనోసైట్ మరియు శోషరస కణుపు కణ ఐసోలేషన్ కోసం, కణజాలం ఒక ప్లంగర్‌తో విడదీయబడింది. ఎముకను 23-గేజ్ సూదితో ఎగరవేయడం ద్వారా ఫెమర్స్ నుండి BM సేకరించబడింది. 2 × పిబిఎస్‌తో ఓస్మోలారిటీని తిరిగి సరిచేయడానికి ముందు స్ప్లెనోసైట్ మరియు బిఎమ్‌లలోని ఎరిథ్రోసైట్ లైసిస్‌ను సెల్ గుళికలకు 20 సెకన్ల పాటు స్వేదనజలం వేయడం ద్వారా ప్రదర్శించారు. సెల్ సస్పెన్షన్లు 50 μm ఫిల్టర్ ద్వారా పంపించబడ్డాయి మరియు RPMI-1640 (థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్) లో 10% (v / v) వేడి-క్రియారహిత FCS, 100 IU ml −1 పెన్సిలిన్ మరియు 100 μg ml −1 స్ట్రెప్టోమైసిన్ లేదా PBS లో భర్తీ చేయబడ్డాయి. .

తయారీదారు సూచనల మేరకు టి కణాలు పాన్ట్ సెల్ ఐసోలేషన్ కిట్ (మిల్టెని, బెర్గిష్ గ్లాడ్‌బాచ్, జర్మనీ) తో వేరుచేయబడ్డాయి. అన్ని ప్రయోగాలలో స్వచ్ఛత> 90%.

కణితి కణజాలం నుండి కణాల వేరుచేయడం

కణితి కణజాలం పిబిఎస్‌లో 2-3 మిమీ ముక్కలుగా కత్తిరించబడింది, 7 నిమిషాలకు 300 గ్రాముల వద్ద సెంట్రిఫ్యూజ్ చేయబడింది మరియు 1 మి.లీ ఎంజైమ్ మిక్స్‌తో 0.2 మి.గ్రా మి.లీ Col1 కొల్లాజినేస్ డి, 0.2 మి.గ్రా మిల్లీ −1 డిస్పాస్ 1 మరియు 0.1 మి.గ్రా మి.లీ -1 డినాస్ (అన్నీ సిగ్మా-ఆల్డ్రిచ్ నుండి). 37 ° C వద్ద 45 నిమిషాల పొదిగే తర్వాత, కణాలు 100 μm వడపోత గుండా పంపబడతాయి మరియు RPMI-1640 లో ఉంచబడతాయి, పైన వివరించిన విధంగా విశ్లేషణ వరకు.

BM చిమెరిక్ ఎలుకల ఉత్పత్తి

C57BL / 6 WT మరియు Tlr3 / 7/9 - / - ఎలుకలు dose- బీమ్ 60 కో సోర్స్ (ఫిలిప్స్, జర్మనీ) నుండి ఒక మోతాదు (9.5–10.5 బూడిద) మొత్తం శరీర వికిరణానికి గురయ్యాయి. C57BL / 6 WT మరియు Tlr3 / 7/9 - / - ఎలుకల నుండి దాత BM కణాలు పైన వివరించిన విధంగా వేరుచేయబడ్డాయి. వికిరణం జరిగిన 1 రోజు తర్వాత గ్రహీత ఎలుకలను 0.2 మి.లీ పిబిఎస్‌లో 5 × 10 6 బిఎమ్ కణాలతో ఇంట్రావీనస్‌గా ఇంజెక్ట్ చేశారు. WT ఎలుకల నుండి BM ను TLR- లోపం ఉన్న ఎలుకలలోకి ప్రవేశపెట్టారు మరియు దీనికి విరుద్ధంగా. అదే జన్యురూపం యొక్క BM ను స్వీకరించే ఎలుకలు నియంత్రణగా పనిచేస్తాయి. హేమాటోపోయిటిక్ పునర్నిర్మాణం సాధించడానికి, ఎలుకలు 8 వారాల వరకు కోలుకోవడానికి అనుమతించబడ్డాయి, 0.5 × 10 6 MOPC కణితి కణాలు ఎలుకల పార్శ్వంలోకి చొప్పించబడతాయి. కణితి పెరుగుదల ప్రతి ఇతర రోజు 1 నెల వరకు కొలుస్తారు.

యాంటీబాడీ-మధ్యవర్తిత్వ క్షీణత

RGr-1 యాంటీబాడీ (RB6-8C5, బయోఎక్స్ సెల్, వెస్ట్ లెబనాన్, USA) 0.9% NaCl లో పలుచన 200 μg యాంటీబాడీని ఇంట్రాపెరిటోనియల్ ఇంజెక్షన్ ద్వారా Gr-1- పాజిటివ్ కణాలను క్షీణింపచేయడానికి ఉపయోగించబడింది. కణితి కణ ఇంజెక్షన్‌కు 3 రోజుల ముందు చికిత్స ప్రారంభమైంది మరియు ప్రయోగం అంతటా ప్రతి మూడవ రోజు పునరావృతమైంది. CD8 లేదా CD4 T కణాల క్షీణత కోసం, 100 μg యాంటీబాడీ (CD8, 2.43, బయోఎక్స్ సెల్ మరియు CD4, GK1.5, BioXCell) 7 రోజుల అనువర్తన వ్యవధిలో అదే విధంగా ఉపయోగించబడింది. కంట్రోల్ గ్రూపులను ఐసోటైప్ యాంటీబాడీ (ఎలుక IgG2a LTF-2, BioXCell) తో నిర్దిష్ట యాంటీబాడీకి వర్తింపజేసిన అదే నియమాన్ని ఉపయోగించి చికిత్స చేశారు. తోక సిరలు మరియు ఫ్లో సైటోమెట్రీ నుండి పరిధీయ రక్తాన్ని ఉపయోగించి క్షీణత ధృవీకరించబడింది.

సెల్ సంస్కృతి SN ల యొక్క సైటోకిన్ విశ్లేషణ

కణితిని వివరించే SN లను ఉత్పత్తి చేయడానికి 48 mg కోసం మాధ్యమంలో 20 mg ml −1 వద్ద 12 mg సగటు బరువుతో కణితి ముక్కలు కల్చర్ చేయబడ్డాయి. SN లు సేకరించబడ్డాయి, కణ శిధిలాలను తొలగించడానికి సెంట్రిఫ్యూజ్ చేయబడ్డాయి మరియు విశ్లేషణ వరకు −20 ° C వద్ద నిల్వ చేయబడ్డాయి.

ముయోరిన్ సైటోకిన్లు IL-6 మరియు IL-24 డుయోసెట్ ఎలిసా కిట్‌లను (R&D సిస్టమ్స్, వైస్‌బాడెన్, జర్మనీ) ఉపయోగించి కనుగొనబడ్డాయి మరియు తయారీదారు ప్రోటోకాల్ ప్రకారం ఆప్టియా సెట్ ఎలిసా కిట్ (BD బయోసైన్సెస్, హైడెల్బర్గ్, జర్మనీ) ఉపయోగించి మౌస్ IFN-found కనుగొనబడింది. 450 nm వద్ద శోషణం సినర్జీ II మైక్రోప్లేట్ రీడర్ (బయోటెక్, బాడ్ ఫ్రెడ్రిచ్‌షాల్, జర్మనీ) తో కొలుస్తారు.

ఫ్లో సైటోమెట్రీ

పిబిఎస్‌లోని ఫ్లోరోక్రోమ్-కపుల్డ్ యాంటీబాడీస్‌తో కణాలు 5% మురిన్ సీరం మరియు 10% ఎఫ్‌సిఎస్‌తో 20 నిమిషాలు 4. C వద్ద భర్తీ చేయబడ్డాయి. కింది యాంటీబాడీ కంజుగేట్లు మరియు సంబంధిత క్లోన్లను ఉపయోగించారు: CD11b-PE-Cy7 (క్లోన్ 3A33, 2 μg ml −1, అబ్కామ్, కేంబ్రిడ్జ్, UK), Ly6G-PerCP-Cy5.5 (క్లోన్ 1A8, 2 μg ml −1, బయోలెజెండ్, ఫెల్, జర్మనీ), CD4-V450 (క్లోన్ 2B11, 4 μg ml −1, BD బయోసైన్సెస్), CD4 (BV605, RM4-5, 0.25 μg ml −1, బయోలెజెండ్), CD8 (AF700, 53-6.7, 1 μg ml −1, eBioscience), CD8-V500 (క్లోన్ 53-6.7, 4 μg ml −1, BD బయోసైన్సెస్), CD3 (AF700, 17A2, 1 μg ml −1, eBioscience), CD107a (ఫ్లోరోసెసిన్ ఐసోథియోసైనేట్, 1D4B, 0.5 μg ml −1, బయోలెజెండ్), CD43 (PerCP, 1B11, 0.25 mlg ml −1, బయోలెజెండ్), CD62L (BV510, Mel14, 0.25 μg ml −1 బయోలెజెండ్), CD154 (PE, MR1, 0.25 mlg ml −1, eBioscience), CD244.2 (APC, eBio244F4, 1 μg ml −1, eBioscience), LAG3 (PE, eBioC9B7W, 0.25 μg ml −1, eBioscience), PD-1 (PE, J43, 1 μg ml −1, eBioscience) మరియు టిమ్ -3 (పెర్సిపి, 215008, 1: 100, ఆర్‌అండ్‌డి). డెడ్ సెల్స్ (ఫిక్సబుల్ వైబిలిటీ డై ఇఫ్లూర్ 780 పాజిటివ్, ఇబయోసైన్స్) మరియు డబుల్స్‌ను విశ్లేషణల నుండి మినహాయించారు. గ్రాన్జైమ్ B (APC, GB12, 0.25 μg ml −1 లైఫ్ టెక్నాలజీస్), Eomes (PerCp-eF710, Dan11mag, 1 μg ml −1, eBioscience) మరియు FoxP3 (PE, eFlour610 FJK-16s, 1 μg ml −1) యొక్క కణాంతర మరక, ఇబయోసైన్స్) తయారీదారు ప్రోటోకాల్ ప్రకారం ఫాక్స్ 3 ఫిక్సేషన్ కిట్ (ఫాక్స్ 3 / ట్రాన్స్క్రిప్షన్ ఫాక్టర్ ఫిక్సేషన్ / పెర్మిబిలైజేషన్ కాన్సంట్రేట్ అండ్ డిల్యూయెంట్, ఇబయోసైన్స్) తో ఫిక్సేషన్ మరియు పారగమ్యత దశ తరువాత ప్రదర్శించారు.

కణాంతర సైటోకిన్ మరక కోసం, శోషరస కణుపు కణాలు మరియు కణితి కణాలు ప్లేట్-బౌండ్ యాంటీ సిడి 3 (145-2C11, 4 μg ml −1, బయోలెజెండ్) మరియు కరిగే యాంటీ సిడి 28 (37.51, 2 mlg ml −1, బయోలెజెండ్) బ్రీఫెల్డిన్ A (2 μg ml −1, సిగ్మా-ఆల్డ్రిచ్) సమక్షంలో 37 ° C వద్ద 4 గం. కణాలు రెండుసార్లు కడుగుతారు, Fc గ్రాహకాలను నిరోధించడానికి Fcγ 2/3 రిసెప్టర్ (2.4G2, 1 μg ml −1, eBioscienc) తో పొదిగేవి మరియు ఉపరితల గుర్తుల కోసం తడిసినవి. కణాలు సైటోఫిక్స్ / సైటోపెర్మ్ కణాంతర స్టెయినింగ్ కిట్ (బెక్టన్ డికిన్సన్) ఉపయోగించి కడిగి, పారగమ్యమయ్యాయి మరియు IL-2 (eF450, JES6-5H4, 0.5 μg ml −1, eBioscience), IFN-γ (ఫ్లోరోసెసిన్) కొరకు ప్రత్యేకమైన మోనోక్లోనల్ యాంటీబాడీస్‌తో ప్రతిస్పందించాయి. ఐసోథియోసైనేట్, XMG1.2, 0.5 μg ml −1, eBioscience) మరియు TNF-α (BV510, MP6-XT22, 1 μg ml −1, బయోలెజెండ్). ఐసోటైప్ కంట్రోల్ యాంటీబాడీస్ నిర్దిష్ట ప్రతిరోధకాల మాదిరిగానే ఏకాగ్రతతో ఉపయోగించబడ్డాయి.

DIVA 6.0 సాఫ్ట్‌వేర్ (BD బయోసైన్సెస్) ఉపయోగించి FACS CantoII వద్ద లేదా ఫ్లోజో (ట్రెస్టార్) ఉపయోగించి LSR II (BD బయోసైన్సెస్) పై డేటా రికార్డ్ చేయబడింది.

జన్యు వ్యక్తీకరణ మైక్రోఅరే విశ్లేషణ

MOPC కణితి కణాలు (2 × 10 6 ) C57BL / 6 WT మరియు Tlr3 / 7/9 - / - ఎలుకలలోకి చొప్పించబడ్డాయి. 6 రోజుల తరువాత, కణితులు విచ్ఛిన్నమై వెంటనే ద్రవ నత్రజనిలో స్తంభింపజేయబడ్డాయి. కణితి కణజాలం యాంత్రికంగా ముక్కలు చేయబడింది మరియు RNeasy MINI కిట్ (కియాగెన్, హిల్డెన్, జర్మనీ) సూచనలను అనుసరించి మొత్తం RNA వేరుచేయబడింది. మైక్రో క్యూట్ G1.0 (ఎపెండోర్ఫ్, వెస్సెలింగ్-బెర్జ్‌డోర్ఫ్, జర్మనీ) మరియు బయోఫోటోమీటర్ (ఎపెండోర్ఫ్) ఉపయోగించి RNA ఏకాగ్రత మరియు స్వచ్ఛత నియంత్రించబడ్డాయి. 3′-IVT ఎక్స్‌ప్రెషన్ ప్లస్ కిట్ (అఫిమెట్రిక్స్, హై వైకాంబే, యుకె) ను ఉపయోగించి రెండు వందల యాభై నానోగ్రాముల ఆర్‌ఎన్‌ఎను పరిపూరకరమైన డిఎన్‌ఎలోకి లిప్యంతరీకరించారు. యూనివర్శిటీ డ్యూయిస్బర్గ్-ఎస్సెన్ యొక్క మెడికల్ ఫ్యాకల్టీ యొక్క బయోచిప్ కోర్ సదుపాయంలో అఫిమెట్రిక్స్ చిప్ (MG-430_2.0) ఉపయోగించి సిడిఎన్ఎ విశ్లేషించబడింది.

పరిమాణాత్మక RT-PCR ద్వారా జన్యు వ్యక్తీకరణ విశ్లేషణ

పరిమాణాత్మక RT-PCR విశ్లేషణ కోసం, మొత్తం RNA ను కణితి కణజాలం నుండి RNeasy కిట్ (కియాగెన్) ఉపయోగించి వేరుచేసి, తయారీదారు సూచనల ప్రకారం (థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్) ప్రకారం యాదృచ్ఛిక-హెక్సామర్ ప్రైమర్ మరియు సూపర్‌స్క్రిప్ట్ II RT తో రివర్స్ ట్రాన్స్క్రిప్ట్ చేయబడింది. క్వాంటిటేటివ్ రియల్ టైమ్ పిసిఆర్ మాగ్జిమా ఎస్వైబిఆర్ గ్రీన్ క్వాంటిటేటివ్ పిసిఆర్ మాస్టర్ మిక్స్ (థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్, బాన్, జర్మనీ) 53 తో నిర్వహించబడింది . ప్రైమర్‌లు అనుబంధ పట్టిక 1 లో ఇవ్వబడ్డాయి. అన్ని ప్రైమర్‌లకు అన్నేలింగ్ ఉష్ణోగ్రత 60 ° C గా ఉంది.

కణితి కణజాలం యొక్క హిస్టాలజీ మరియు ఇమ్యునోహిస్టోకెమిస్ట్రీ

కణితి కణజాలం ద్రవ నత్రజనిపై సరైన కట్టింగ్ ఉష్ణోగ్రత (OCT) ఎంబెడ్డింగ్ మాధ్యమంలో స్తంభింపచేయబడింది మరియు −80. C వద్ద నిల్వ చేయబడుతుంది. 5 μm మందంతో ఘనీభవించిన విభజన జరిగింది. పదనిర్మాణ విశ్లేషణ కోసం, హేమాటాక్సిలిన్-ఇయోసిన్ చేత కణితులు తడిసినవి. సైటోఫిక్స్ / సైటోపెర్మ్ కిట్ (బిడి బయోసైన్సెస్) తో కణజాలం మరియు హైడ్రోజన్ పెరాక్సైడ్ (డాకో, హాంబర్గ్, జర్మనీ) తో పొదిగిన తరువాత కలర్మెట్రిక్ ఇమ్యునోహిస్టోకెమిస్ట్రీ జరిగింది. గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద 60 నిమిషాలు ముక్కలు తేమతో కూడిన గదిలో ప్రాధమిక మోనోక్లోనల్ యాంటీబాడీతో పొదిగేవి. తదనంతరం, నమూనాలను సెకండరీ యాంటీబాడీస్‌తో 30 నిమిషాలు మరియు 10 నిమిషాలు AEC సింగిల్ సొల్యూషన్ (థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్) తో పొదిగించారు. న్యూక్లియైలను షాండన్ ఇన్‌స్టంట్ హేమాటాక్సిలిన్ (థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్) 28 ద్వారా దృశ్యమానం చేశారు. కింది ప్రాధమిక (ఎలుక- mouse- మౌస్) మరియు ద్వితీయ ప్రతిరోధకాలు ఉపయోగించబడ్డాయి: ఎలుక αCD31 (క్లోన్ MEC13.3, 1: 1, 000), ఎలుక αGR1 (క్లోన్ RB6-8C5, 1: 100), ఎలుక αCD4 (క్లోన్ RM4-5, 1: 500, అన్నీ BD బయోసైన్సెస్ నుండి), ఎలుక αCD11b (క్లోన్ M1 / ​​70.15, 1: 1, 000; థర్మో సైంటిఫిక్), ఎలుక αCD8α (క్లోన్ KT15, 1: 500, అబ్డి సెరోటెక్ / బయో-రాడ్, డ్యూసెల్డార్ఫ్, జర్మనీ), కుందేలు es డెస్మిన్ (ab15200, 1: 600, అబ్కామ్), కుందేలు α- ఎలుక HRPO, మేక α- కుందేలు HRPO (రెండూ 1: 100, డయానోవా, హాంబర్గ్, జర్మనీ), గాడిద α- కుందేలు-అలెక్సా 594 (1: 800) మరియు మేక α- ఎలుక -అలెక్సా 488 (1: 200) (రెండూ థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్ నుండి).

ఎలుక αCD31 (1: 1, 000) మరియు కుందేలు as కాస్పేస్ 3 (క్రియాశీల) (1: 100, R&D సిస్టమ్స్), మరియు ఎలుక αCD4 (1: తో 4 ° C వద్ద రాత్రిపూట BD సైటోఫిక్స్ / సైటోపెర్మ్‌తో ఫిక్సేషన్ తర్వాత కణితి కణజాలం యొక్క డబుల్ ఫ్లోరోసెన్స్ మరకను ప్రదర్శించారు. 500) లేదా ఎలుక αCD8 (1: 500) గొర్రెలతో కలిసి αKi67 / MKI67 (1: 200, R&D సిస్టమ్స్), తరువాత గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద 30 నిమిషాలు మరకతో ద్వితీయ కారకాలు మేక- α- కుందేలు Cy3, గాడిద- sheep- గొర్రెలు సై 3 (రెండూ 1: 400, డయానోవా) మరియు మేక- rat- ఎలుక అలెక్సా 488 (1: 200, థర్మో సైంటిఫిక్). న్యూక్లియైలు 4, 6-డయామిడినో -2 ఫినైలిండోల్ స్టెయినింగ్ (1: 36, 000, బయోలెజెండ్) ద్వారా దృశ్యమానం చేయబడ్డాయి. వాస్కులర్ పరిపక్వత యొక్క ధృవీకరణ కోసం, కణితికి ఐదు క్షేత్రాల వరకు మాన్యువల్ లెక్కింపు ద్వారా డెస్మిన్-పాజిటివ్ నాళాలు లెక్కించబడ్డాయి, వీటిలో మొత్తం 100 నాళాలు ఉన్నాయి, సమిష్టి దూరం 29 యొక్క కణితికి (పై, మధ్య మరియు బేస్) మూడు కణితి విభాగాల సగటును ఉపయోగించి.

కణితి-చొరబాటు లింఫోసైట్లు మరియు నాళాల పరిమాణీకరణ కోసం, ప్రయోగంలో సూచించిన విధంగా యాక్సియోస్కోప్ 2 (కార్ల్ జీస్, జెనా, జర్మనీ) మరియు ఆక్సియోవిజన్ (కార్ల్ జీస్) సాఫ్ట్‌వేర్‌లను ఉపయోగించి చిత్రాలు తీయబడ్డాయి. Cells 200 మాగ్నిఫికేషన్ వద్ద తీసుకున్న నాలుగు సూక్ష్మ క్షేత్రాల వ్యక్తిగత కణాల మాన్యువల్ లెక్కింపు ద్వారా కణాలు లెక్కించబడ్డాయి. స్వతంత్ర పరిశోధకులు కంటి చూపుతో పరిమాణాన్ని చేశారు. కణితికి ఐదు క్షేత్రాల వరకు మాన్యువల్ లెక్కింపు ద్వారా మొత్తం 100 నాళాలతో సహా, కణితికి మూడు కణితి విభాగం యొక్క సగటును ఉపయోగించి (ఎగువ, మధ్య మరియు బేస్) సమన్వయ దూరం యొక్క పెర్సైసైట్ కవరేజ్ యొక్క పరిమాణీకరణ జరిగింది. BX51 (ఒలింపస్, హాంబర్గ్, జర్మనీ) మరియు సంబంధిత సెల్ పి సాఫ్ట్‌వేర్‌ను ఉపయోగించి నౌక విశ్లేషణ జరిగింది. ప్రతినిధి చిత్రాల కోసం, ఫోటోషాప్ CS5 (అడోబ్ సిస్టమ్స్, శాన్ జోస్, USA) లో ఒకేసారి ఒకే ఫైల్‌లో చిత్రాలు ప్రాసెస్ చేయబడ్డాయి.

కణ మరణం యొక్క నిర్ధారణ

తయారీదారుల ప్రోటోకాల్ ప్రకారం, ఫ్లో సైటోమెట్రీ ద్వారా అనెక్సిన్వి: పిఇ అపోప్టోసిస్ డిటెక్షన్ కిట్ (బిడి బయోసైన్సెస్) ఉపయోగించి కల్చర్డ్ కణాల అపోప్టోసిస్ కనుగొనబడింది. కణితి కణజాలం యొక్క స్తంభింపచేసిన విభాగాలలో, మొత్తం మొత్తంలో అపోప్టోటిక్ కణాలు APO-DIRECT TUNEL రంజనం (BD బయోసైన్సెస్) చేత లెక్కించబడ్డాయి. 7-అమైనోయాక్టినోమైసిన్ డి (7-ఎఎడి) (బిడి బయోసైన్సెస్) ను న్యూక్లియర్ స్టెయినింగ్‌గా ఉపయోగించారు. మొత్తం కణితి ప్రాంతానికి సంబంధించి ట్యూనెల్-పాజిటివ్ కణాల సంఖ్యను నిర్ణయించడానికి, ఇమేజ్ J సాఫ్ట్‌వేర్ (NIH, బెథెస్డా, USA) ఉపయోగించి × 25 మాగ్నిఫికేషన్ వద్ద తీసిన డిజిటల్ చిత్రాలు విశ్లేషించబడ్డాయి.

కణితి క్లియరింగ్ మరియు అల్ట్రామిక్రోస్కోపీ

MOPC −eGFP కణాలు (1 × 10 6 ) WT మరియు Tlr3 / 7/9 - / - ఎలుకలలోకి చొప్పించబడ్డాయి. నౌక మరక అవసరమైతే, ఎలుక- mouse- మౌస్ CD31 (క్లోన్ MEC13.3, బయోలెజెండ్) యాంటీబాడీతో పాటు అలెక్సా ఫ్లోర్ 647 ప్రతి యాంటీబాడీ (20 μg ml −1 ) లో రెట్రోబుల్‌బార్లీగా ఇంజెక్ట్ చేయబడింది. కెటమైన్ మరియు జిలాజైన్ మోతాదును కిలో శరీర బరువుకు వరుసగా 100 మరియు 10 మి.గ్రా చొప్పున ఇంట్రాపెరిటోనియల్ అప్లికేషన్ ద్వారా అనస్థీషియా కింద ఇంజెక్షన్ నిర్వహించారు మరియు శరీర బరువుకు 10 μl ఇంజెక్షన్ కోసం 0.9% NaCl లో కరిగించారు. ఇరవై నిమిషాల తరువాత, గుండె యొక్క ఎడమ జఠరికలోకి 20 ml 5 mM EDTA / PBS (pH 7.2) ను ఇంజెక్ట్ చేయడం ద్వారా ఎలుకలు చంపబడ్డాయి మరియు పెర్ఫ్యూజ్ చేయబడ్డాయి, తరువాత 20 ml 4% పారాఫార్మల్డిహైడ్ (PFA). కణితులు విచ్ఛిన్నమయ్యాయి మరియు 3DISCO ప్రోటోకాల్ 54 క్లియరింగ్ కోసం ఉపయోగించబడింది. క్లుప్తంగా, టెట్రాహైడ్రోఫ్యూరాన్‌లో కణితులు 30 నిమిషాల చొప్పున పెరుగుతున్న ఏకాగ్రతతో (30, 50, 80, 100% (వి / వి)) పొదిగేవి. డైబెన్జైల్ ఈథర్లో తదుపరి పొదిగే రాత్రిపూట ప్రదర్శించారు. లావిజన్ బయోటెక్ అల్ట్రామిక్రోస్కోప్ (ఒలింపస్) యొక్క లైట్‌షీట్ ప్రకాశం పద్ధతిని ఉపయోగించి కణితుల వాస్కులరైజేషన్ విశ్లేషించబడింది. ImageJ మరియు Imaris 8.0.2 సాఫ్ట్‌వేర్ (ఇమారిస్, కొలోన్, జర్మనీ) ఉపయోగించి డేటాను విశ్లేషించారు.

అడాప్టివ్ బదిలీ

స్వీకర్త WT మరియు Tlr3 / 7/9 - / - ఎలుకలను దత్తత బదిలీకి 6 రోజుల ముందు 1 × 10 6 MOPC −eGFP కణితి కణాలతో ఇంజెక్ట్ చేశారు. దాత ఎలుకలను 1 × 10 6 MOPC −eGFP కణితి కణాలతో ఇంజెక్ట్ చేశారు. WT మరియు Tlr3 / 7/9 - / - యొక్క స్ప్లెనోసైట్లు 1 μM సెల్ట్రాకర్ డీప్ రెడ్ డై (థర్మో సైంటిఫిక్) తో వేరుచేయబడి, లేబుల్ చేయబడ్డాయి. లేబుల్ చేయబడిన స్ప్లెనోసైట్లు (10 × 10 6 ) గ్రహీత ఎలుకలలోకి ఇంట్రావీనస్ ద్వారా ఇంజెక్ట్ చేయబడ్డాయి. ఒక రోజు తరువాత, కణితులు విచ్ఛిన్నమై క్లియర్ చేయబడ్డాయి. అల్ట్రామిక్రోస్కోపీని ఉపయోగించి 3 డి చిత్రాలను రూపొందించడం ద్వారా బదిలీ చేయబడిన స్ప్లెనోసైట్ల చొరబాట్లను పరిశీలించారు.

గణాంక విశ్లేషణ

రెండు సమూహాల పోలిక లేదా రెండు కంటే ఎక్కువ సమూహాలను పోల్చినట్లయితే వైవిధ్యం యొక్క విశ్లేషణ కోసం విద్యార్థుల టి -టెస్ట్ తో గణాంక ప్రాముఖ్యత అంచనా వేయబడింది. ప్రతి ప్రయోగానికి సమూహానికి ఎలుకల సంఖ్య సూచించబడుతుంది మరియు చాలా ప్రయోగాలకు వ్యక్తిగత ఎలుకలు చూపబడతాయి. మునుపటి ప్రాథమిక డేటా ఆధారంగా నమూనా పరిమాణం నిర్ణయించబడింది. జంతువులను విశ్లేషణ నుండి మినహాయించలేదు మరియు ప్రయోగాత్మక సమూహాలకు జంతువులను కేటాయించడానికి యాదృచ్ఛికీకరణ యొక్క స్పష్టమైన పద్ధతి ఉపయోగించబడలేదు. * P 0.05, ** P 0.005 మరియు *** P 0.0005 వద్ద ఫలితాలు ముఖ్యమైనవిగా పరిగణించబడ్డాయి. R సాఫ్ట్‌వేర్ (ది R ఫౌండేషన్ ఫర్ స్టాటిస్టికల్ కంప్యూటింగ్, వియన్నా, ఆస్ట్రియా) తో జన్యు వ్యక్తీకరణ డేటా యొక్క క్రమానుగత క్లస్టరింగ్ జరిగింది.

డేటా లభ్యత

ఈ వ్యాసంలోని ఫలితాలను సమర్థించే మైక్రోఅరే డేటా ఎన్‌సిబిఐ యొక్క జీన్ ఎక్స్‌ప్రెషన్ ఆమ్నిబస్‌లో GEO సిరీస్ యాక్సెషన్ కోడ్ GSE92358 క్రింద జమ చేయబడింది. ఈ అధ్యయనం సమయంలో ఉత్పత్తి చేయబడిన లేదా విశ్లేషించబడిన అన్ని ఇతర డేటా ఈ ప్రచురించిన వ్యాసం మరియు దాని అనుబంధ సమాచార ఫైళ్ళలో చేర్చబడింది లేదా సహేతుకమైన అభ్యర్థనపై సంబంధిత రచయిత నుండి లభిస్తుంది.

ప్రవేశాల

జన్యు వ్యక్తీకరణ ఓమ్నిబస్

  • GSE92358

అనుబంధ సమాచారం

PDF ఫైళ్లు

  1. 1.

    అనుబంధ సమాచారం

    అనుబంధ గణాంకాలు మరియు అనుబంధ పట్టిక

  2. 2.

    పీర్ రివ్యూ ఫైల్

వీడియోలు

  1. 1.

    అనుబంధ చిత్రం 1

    WT మౌస్ యొక్క క్లియర్ చేసిన కణితుల్లో నౌక నిర్మాణం. పన్నెండు నుండి పదహారు వారాల వయస్సు గల C57BL / 6 WT ఎలుకలు పెర్ఫ్యూజ్ చేయబడ్డాయి మరియు MOPC-eGFP కణితి కణాలు (ఆకుపచ్చ) ఇంజెక్షన్ చేసిన పది రోజుల తరువాత sc కణితులను శస్త్రచికిత్స ద్వారా తొలగించారు. అలెక్సా ఫ్లోర్ 647 కపుల్డ్ ఎసిడి 31 యాంటీబాడీ (ఎరుపు) ఇంజెక్షన్ ద్వారా నాళాలు వివోలో తడిసినవి. కణితి కణజాలం 3DISCO ప్రోటోకాల్ ఉపయోగించి క్లియర్ చేయబడింది మరియు లైట్ షీట్ మైక్రోస్కోపీ ద్వారా విశ్లేషించబడింది. ఇమేజ్‌జే మరియు ఇమారిస్ సాఫ్ట్‌వేర్‌లను ఉపయోగించి 3 డి సినిమాలు సృష్టించబడ్డాయి. వీడియో ఒక ప్రతినిధి ఉదాహరణను చూపుతుంది.

  2. 2.

    అనుబంధ చిత్రం 2

    Tlr3 / 7/9 - / - మౌస్ యొక్క క్లియర్ చేసిన కణితుల్లో నాళాల నిర్మాణం. పన్నెండు నుండి పదహారు వారాల వయస్సు గల Tlr3 / 7/9 - / - WT ఎలుకలు పెర్ఫ్యూజ్ చేయబడ్డాయి మరియు MOPC-eGFP కణితి కణాలు (ఆకుపచ్చ) ఇంజెక్షన్ చేసిన పది రోజుల తరువాత sc కణితులను శస్త్రచికిత్స ద్వారా తొలగించారు. అలెక్సా ఫ్లోర్ 647 కపుల్డ్ α సిసి 31 యాంటీబాడీ (ఎరుపు) ఇంజెక్షన్ ద్వారా నాళాలు వివోలో తడిసినవి. కణితి కణజాలం 3DISCO ప్రోటోకాల్ ఉపయోగించి క్లియర్ చేయబడింది మరియు లైట్ షీట్ మైక్రోస్కోపీ ద్వారా విశ్లేషించబడింది. ఇమేజ్‌జే మరియు ఇమారిస్ సాఫ్ట్‌వేర్‌లను ఉపయోగించి 3 డి సినిమాలు సృష్టించబడ్డాయి. వీడియో ఒక ప్రతినిధి ఉదాహరణను చూపుతుంది.

వ్యాఖ్యలు

వ్యాఖ్యను సమర్పించడం ద్వారా మీరు మా నిబంధనలు మరియు సంఘ మార్గదర్శకాలకు కట్టుబడి ఉండాలని అంగీకరిస్తున్నారు. మీరు దుర్వినియోగమైనదాన్ని కనుగొంటే లేదా అది మా నిబంధనలు లేదా మార్గదర్శకాలకు అనుగుణంగా లేనట్లయితే దయచేసి దాన్ని అనుచితమైనదిగా ఫ్లాగ్ చేయండి.