మైలోడిస్ప్లాస్టిక్ సిండ్రోమ్స్‌లో క్లోనల్ ఎవాల్యూషన్ | ప్రకృతి సమాచార మార్పిడి

మైలోడిస్ప్లాస్టిక్ సిండ్రోమ్స్‌లో క్లోనల్ ఎవాల్యూషన్ | ప్రకృతి సమాచార మార్పిడి

Anonim

విషయము

  • క్యాన్సర్ జన్యుశాస్త్రం
  • మైలోడిస్ప్లాస్టిక్ సిండ్రోమ్

నైరూప్య

క్యాన్సర్ అభివృద్ధి అనేది ఒక డైనమిక్ ప్రక్రియ, ఈ సమయంలో వరుసగా ఉత్పరివర్తనలు చేరడం వలన ప్రాణాంతక లక్షణాలతో కణాలు ఏర్పడతాయి. ఇక్కడ, లెనాలిడోమైడ్తో లేదా లేకుండా (2.5–11 సంవత్సరాలు ఫాలో-అప్) సహాయక సంరక్షణ పొందుతున్న మైలోడిస్ప్లాస్టిక్ సిండ్రోమ్ (MDS) రోగులలో క్లోనల్ పరిణామ నమూనాను మేము చూపిస్తాము. వ్యాధి-కోర్సు సమయంలో బహుళ-సమయ పాయింట్ల వద్ద సంపూర్ణ-ఎక్సోమ్ మరియు టార్గెట్డ్ డీప్ సీక్వెన్సింగ్, వ్యాధి-సవరించే చికిత్సతో మరియు లేకుండా సరళ మరియు శాఖల పరిణామ నమూనాలు సంభవిస్తాయని తెలుపుతుంది. వ్యాధి-సవరించే చికిత్స యొక్క అనువర్తనం ఒక పరిణామ అడ్డంకిని సృష్టించవచ్చు, ఆ తరువాత మరింత సంక్లిష్టమైన MDS, కానీ హేమాటోపోయిటిక్ కణాల సంబంధం లేని క్లోన్లు కూడా బయటపడవచ్చు. అదనంగా, చికిత్సా నిరోధకత ( TP53 ) లేదా వ్యాధి పురోగతి ( NRAS , KRAS ) తో అనుబంధించబడిన అదనపు మ్యుటేషన్‌ను పొందిన సబ్‌క్లోన్‌లు క్లినికల్ మార్పులు స్పష్టంగా కనబడటానికి కొన్ని నెలల ముందు కనుగొనబడతాయి. వ్యాధి సమయంలో జన్యు ప్రకృతి దృశ్యాన్ని పర్యవేక్షించడం చికిత్స నిర్ణయాలకు మార్గనిర్దేశం చేస్తుంది.

పరిచయం

మైలోడీస్ప్లాస్టిక్ సిండ్రోమ్స్ (MDS లు) అనేది హేమాటోపోయిటిక్ నియోప్లాజమ్‌ల యొక్క భిన్నమైన సమూహం, ఇది అసాధారణ భేదం, డైస్ప్లాసియా మరియు పరిధీయ రక్త సైటోపెనియాస్ ద్వారా వర్గీకరించబడుతుంది. అక్యూట్ మైలోయిడ్ లుకేమియా (AML) వైపు పురోగతి ∼ 30% రోగులలో సంభవిస్తుంది. MDS యొక్క వ్యాధికారక ఉత్పత్తికి అంతర్లీనంగా ఉన్న వివిధ జన్యు ఉత్పరివర్తనలు గుర్తించబడ్డాయి. పునరావృతమయ్యే చాలా జన్యువులను ట్రాన్స్క్రిప్షన్ కారకాలు, సిగ్నల్ ట్రాన్స్డక్షన్ ప్రోటీన్లు, ఎపిజెనెటిక్ మాడిఫైయర్స్, ఆర్‌ఎన్‌ఎ స్ప్లికింగ్‌లో పాల్గొన్న ప్రోటీన్లు మరియు కోహసిన్ కాంప్లెక్స్ 1, 2, 3 యొక్క ప్రోటీన్‌లుగా వర్గీకరించవచ్చు. సాధారణంగా, ఇచ్చిన MDS రోగిలో, అనేక ఉత్పరివర్తనలు ఒకేసారి ఉంటాయి. MDS ఉన్న వేర్వేరు వ్యక్తులలో వివిధ జన్యువులు పునరావృతమవుతాయి మరియు వ్యాధి యొక్క వ్యాధికారకంలో (డ్రైవర్ ఉత్పరివర్తనలు) పాత్ర పోషిస్తాయి, కానీ యాదృచ్ఛికంగా, జీవితకాలంలో వ్యక్తిగత కణాలలో పొందిన యాదృచ్ఛిక, నాన్‌పాథోజెనిక్ ఉత్పరివర్తనలు కనుగొనబడతాయి, ఎందుకంటే ఇవి క్లోనల్‌గా కలిసి విస్తరించబడతాయి వ్యాధి అభివృద్ధి సమయంలో వ్యాధికారక ఉత్పరివర్తనలు (ప్రయాణీకుల ఉత్పరివర్తనలు) 4 . ఆంకోజెనిసిస్ ఒక మల్టీస్టెప్ పరిణామ ప్రక్రియగా భావిస్తారు. ఎంపిక చేసిన ప్రయోజనాన్ని అందించే అనేక ఉత్పరివర్తనాల వరుస సముపార్జన కణాల జనాభా యొక్క ఆవిర్భావానికి దారితీయవచ్చు, ఇవి ఒకే రకమైన ఉత్పరివర్తనాలను కలిగి ఉంటాయి 5, 6 .

పరిణామం యొక్క సరళ మరియు శాఖల నమూనాలు వివరించబడ్డాయి. లీనియర్ పరిణామం అదనపు ఉత్పరివర్తనాలను పొందిన తరువాత వారి పూర్వీకుల క్లోన్‌ను అధిగమిస్తున్న ఆధిపత్య క్లోన్‌ల యొక్క వరుస రూపాన్ని కలిగి ఉంటుంది. బ్రాంచింగ్ పరిణామం ఒక సాధారణ పూర్వీకుల క్లోన్ నుండి వేర్వేరు సబ్‌క్లోన్‌ల ఆవిర్భావం ద్వారా వర్గీకరించబడుతుంది, ఇది 7, 8 పాక్షికంగా అతివ్యాప్తి చెందుతున్న ఉత్పరివర్తనాల సమూహాన్ని కలిగి ఉన్న సంబంధిత (ఉప) క్లోన్‌ల సహజీవనానికి దారితీస్తుంది. ఈ సహ-సబ్‌క్లోన్‌లలోని జన్యు వైవిధ్యం రకం వ్యాధికి చికిత్స చేయడం మరింత కష్టతరం చేస్తుంది, ఎందుకంటే కొన్ని సబ్‌క్లోన్లు నిర్దిష్ట రకాల చికిత్సలకు నిరోధకతను కలిగి ఉంటాయి.

అనేక అధ్యయనాలు MDS మరియు AML 5, 9, 10, 11, 12, 13, 14 లలో జన్యు పరిణామాన్ని నమోదు చేశాయి . ల్యుకేమిక్ పరివర్తనకు ముందు లేదా లేకుండా MDS రోగులలో పరిణామ నమూనాలు చాలా తక్కువగా ఉన్నాయి మరియు తరచూ రోగికి పరిమిత సంఖ్యలో నమూనాల విశ్లేషణపై ఆధారపడి ఉంటాయి. ఈ అధ్యయనంలో, MDS రోగులలో క్లోనల్ పరిణామం యొక్క లోతైన విశ్లేషణను మేము సుదీర్ఘకాలం అనుసరించాము. సరళ మరియు శాఖల పరిణామ నమూనాలు రెండూ MDS లో సంభవిస్తాయని మేము చూపించాము మరియు క్లోనల్ పరిణామం చికిత్స ద్వారా ప్రభావితమవుతుంది.

ఫలితాలు

MDS రోగుల జన్యు విశ్లేషణ

మేము మొత్తం-ఎక్సోమ్ సీక్వెన్సింగ్ (WES) ద్వారా క్లోనల్ పరిణామాన్ని అంచనా వేసాము, తరువాత 11 MDS రోగులలో (టేబుల్ 1) లక్ష్యంగా ఉన్న లోతైన సీక్వెన్సింగ్. టి-సెల్ DNA ను జెర్మ్‌లైన్ నియంత్రణగా ఉపయోగించారు. అదనంగా, కల్చర్డ్ మెసెన్చైమల్ స్ట్రోమల్ సెల్స్ (ఎంఎస్సి) నుండి వచ్చిన డిఎన్ఎను ఐదుగురు రోగులలో సూచనగా ఉపయోగించారు. ఆరుగురు రోగులకు సహాయక సంరక్షణ (మార్పిడి, వృద్ధి కారకాలు) మాత్రమే లభించగా, ఐదుగురు రోగులు కూడా లెనాలిడోమైడ్ పొందారు. అన్ని ఉత్పరివర్తనాలను సంగ్రహించడానికి, WES మొదటి మరియు చివరి మరియు అనేక ఇంటర్మీడియట్ టైమ్ పాయింట్లలో ( n = 45) ప్రదర్శించబడింది. అదనంగా, శకలం పొడవు విశ్లేషణ ద్వారా FLT3-ITD కనుగొనబడింది. ఇంకా, నిర్దిష్ట సందర్భాల్లో, మైలోయిడ్ ప్రాణాంతకతలలో (సప్లిమెంటరీ టేబుల్స్ 1 మరియు 2) పునరావృతమయ్యే జన్యువుల ప్యానెల్‌ను లక్ష్యంగా చేసుకుని యాంప్లికాన్-ఆధారిత డీప్ సీక్వెన్సింగ్ ఉపయోగించబడింది. గుర్తించబడిన అన్ని ఉత్పరివర్తనలు ప్రతి రోగి యొక్క అందుబాటులో ఉన్న అన్ని నమూనాలలో లక్ష్యంగా ఉన్న లోతైన క్రమం ద్వారా ధృవీకరించబడ్డాయి మరియు లెక్కించబడ్డాయి (సగటున 10, 616 రెట్లు కవరేజ్). 158 వేర్వేరు జన్యువులలో, 176 వేర్వేరు పొందిన సోమాటిక్ ఉత్పరివర్తనలు గుర్తించబడ్డాయి (అనుబంధ డేటా 1). పొందిన జన్యు ఉత్పరివర్తనాల సగటు సంఖ్య రోగికి 17 (పరిధి 8–27). వీటిలో, రోగికి నాలుగు ఉత్పరివర్తనాల మధ్యస్థం (పరిధి 0–6) గతంలో మైలోయిడ్ ప్రాణాంతకతలలో చిక్కుకున్న జన్యువులలో ఉన్నాయి మరియు వాటిని డ్రైవర్ మ్యుటేషన్లుగా పరిగణిస్తారు (Fig. 1a, c). వృద్ధాప్యంలో జన్యు మార్పుల సంచితానికి అనుగుణంగా, రోగి యొక్క వయస్సు ( P = 0.03, Fig. 1b) తో సంబంధం ఉన్న ప్రతి రోగి యొక్క మొదటి నమూనాలో కనుగొనబడిన మొత్తం జన్యు లోపాలు. నాన్‌సైనమస్ సింగిల్-న్యూక్లియోటైడ్ వైవిధ్యాలు (SNV లు) ( n = 145, 82%) (Fig. 1d) చాలా తరచుగా మార్పులు చేయబడ్డాయి. అన్ని SNV లలో, 65% ( n = 105) పరివర్తనాలు, ప్రధానంగా G: C A: T (53%, Fig. 1e). ఇచ్చిన రోగి నుండి అన్ని నమూనాలలో కొన్ని ఉత్పరివర్తనలు కనుగొనబడ్డాయి, మరికొన్ని ప్రారంభ లేదా చివరి సమయ బిందువులలో మాత్రమే కనిపించాయి, ఇది జన్యు పరిణామాన్ని సూచిస్తుంది (అనుబంధ Fig. 1). రెండు వేర్వేరు చికిత్సా సమూహాలలో (సప్లిమెంటరీ Fig. 2) చివరి ఉత్పరివర్తనాలతో ప్రారంభంలో పోల్చినప్పుడు SNV ల రకం (పరివర్తనాలు లేదా పరివర్తనాలు) పై చికిత్స యొక్క పెద్ద ప్రభావం గమనించబడలేదు. అందుబాటులో ఉన్న అన్ని సమయ బిందువులలో (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్స్ 3 మరియు 4) వేరియంట్ అల్లెల్ ఫ్రీక్వెన్సీల (VAF లు) ఆధారంగా, ఉత్పరివర్తనలు సమూహంగా ఉన్నాయి మరియు క్లోనల్ కూర్పు మరియు పరిణామ నమూనాలు పునర్నిర్మించబడ్డాయి (అత్తి 2 మరియు 3). క్లోనల్ పరిణామాన్ని పునర్నిర్మించేటప్పుడు అధిక-సాంద్రత కలిగిన సింగిల్-న్యూక్లియోటైడ్ పాలిమార్ఫిజం (ఎస్ఎన్పి) శ్రేణుల (సప్లిమెంటరీ టేబుల్ 3) మరియు సాంప్రదాయ సైటోజెనెటిక్ విశ్లేషణ (సప్లిమెంటరీ డేటా 2) నుండి ఫలితాలు తీసుకోబడ్డాయి.

పూర్తి పరిమాణ పట్టిక

Image

( ) MDS ఉన్న 11 మంది రోగులలో పొందిన ఉత్పరివర్తనాల సంఖ్య, అనేక సమయ బిందువులలో (సప్లిమెంటరీ డేటా 1) పూర్తి-ఎక్సోమ్ సీక్వెన్సింగ్ ద్వారా నిర్ణయించబడుతుంది మరియు యాంప్లికాన్-ఆధారిత డీప్ సీక్వెన్సింగ్ ద్వారా నిర్ధారించబడింది. లేత బూడిద రంగులో, మైలోయిడ్ ప్రాణాంతకత యొక్క వ్యాధికారకంలో గతంలో చిక్కుకున్న జన్యువులలో ఉత్పరివర్తనాల సంఖ్య సూచించబడుతుంది (డ్రైవర్ ఉత్పరివర్తనలు) 2, 3, 25, 41, 42, 43, 44, మరియు ముదురు బూడిద రంగులో గతంలో సూచించని ఉత్పరివర్తనాల సంఖ్య మైలోయిడ్ ప్రాణాంతకత (పుటేటివ్ ప్యాసింజర్ మ్యుటేషన్స్). ( బి ) మొదటి మాదిరి సమయంలో వయస్సు మరియు జన్యు లోపాల సంఖ్య (జన్యు మరియు సైటోజెనెటిక్ లోపాలు) మధ్య సానుకూల సహసంబంధాన్ని గమనించవచ్చు. పియర్సన్ యొక్క సహసంబంధ గుణకం (స్టూడెంట్స్ టి -టెస్ట్ లెక్కించిన రెండు-తోక P విలువతో సహా) నిర్ణయించబడింది. ( సి ) ప్రతి రోగికి, మైలోయిడ్ ప్రాణాంతకతలలో పునరావృతమయ్యే జన్యువులలోని అన్ని ఉత్పరివర్తనలు అలాగే అధిక-రిజల్యూషన్ SNP శ్రేణి మరియు / లేదా కార్యోటైప్ విశ్లేషణ ద్వారా కనుగొనబడిన అన్ని సైటోజెనెటిక్ లోపాలు వర్ణించబడతాయి. అత్తి 2 మరియు 3 లో వర్ణించిన విధంగా రంగులు (ఉప) క్లోన్‌లతో సరిపోలుతాయి. * ఒక మార్చబడిన జన్యువును సూచిస్తుంది, ఇది కాపీ సంఖ్య లాభం లేదా నష్టం లేదా హెటెరోజైగోసిటీ (CN-LOH) యొక్క కాపీ-తటస్థ నష్టం ద్వారా కూడా ప్రభావితమవుతుంది; '2' ఒకే జన్యువును ప్రభావితం చేసే రెండు వేర్వేరు ఉత్పరివర్తనాలను సూచిస్తుంది. ( డి ) మొత్తం రోగుల సమూహంలో కనుగొనబడిన వివిధ రకాల మార్పుల పంపిణీ. ( ) ముదురు బూడిద రంగులో మరియు లేత బూడిద రంగులో పరివర్తనాలతో, అన్ని రోగులలో వివిధ రకాల సింగిల్-న్యూక్లియోటైడ్ మార్పులు కనుగొనబడ్డాయి.

పూర్తి పరిమాణ చిత్రం

Image

( ) 8 సంవత్సరాల ఫాలో-అప్ సమయంలో క్లోనల్ పరిణామం లేకుండా ఒకే సింగిల్ ఎండిఎస్ క్లోన్ ఉన్న రోగి. ( బి, సి ) సరళ క్లోనల్ పరిణామాన్ని చూపించే ఇద్దరు రోగులు. రెండు సందర్భాల్లో, పెరిగిన ల్యూకోసైట్ స్థాయిలు మరియు వ్యాధి పురోగతితో సంబంధం ఉన్న ఒక భిన్నమైన NRAS మ్యుటేషన్ (గ్రీన్ క్లోన్స్) పొందబడింది. ( d - f ) మరింత సంక్లిష్టమైన శాఖల క్లోనల్ పరిణామ నమూనా కలిగిన రోగులు. నిలువు గీతల పంక్తులు పరిశోధించిన నమూనా క్షణాలను సూచిస్తాయి. త్రిభుజంతో సూచించిన నమూనాలను WES విశ్లేషించింది. తదనంతరం, అన్ని నమూనాలను లక్ష్యంగా చేసుకున్న లోతైన సీక్వెన్సింగ్‌తో విశ్లేషించారు. ముఖ్యమైన జన్యుపరమైన ఉల్లంఘనలు మాత్రమే సూచించబడతాయి; జన్యుపరమైన ఉల్లంఘనల యొక్క పూర్తి జాబితాను అనుబంధ అత్తి 3 మరియు 4, అనుబంధ పట్టిక 3 మరియు అనుబంధ డేటా 1 మరియు 2. పిసిడి, పెంటాక్సిఫైలైన్, సిప్రోఫ్లోక్సాసిన్ మరియు డెక్సామెథాసోన్; టిపి + బోర్టెజో, టిపిఫార్నిబ్ మరియు బోర్టెజోమిబ్.

పూర్తి పరిమాణ చిత్రం

Image

( - డి ) డెల్ (5 క్యూ) ని కలిగి ఉన్న నలుగురు రోగులు లెనాలిడోమైడ్ చికిత్సకు బాగా స్పందించారు. UPN01 ( ) సరళ పరిణామ నమూనాను చూపిస్తుంది. UPN08, 09 మరియు 10 ( బి - డి ) లలో, లెనాలిడోమైడ్ చికిత్సలో MDS- సంబంధిత క్లోనల్ జనాభా పౌన frequency పున్యంలో పెరిగింది. MDS క్లోనల్ జనాభా UPN08 మరియు 09 లలో సరళ పరిణామాన్ని అనుసరించింది మరియు UPN10 లో ఒక శాఖల పరిణామం. ( ) సాధారణ కార్యోటైప్ ఉన్న రోగి మరియు లెనాలిడోమైడ్ చికిత్సకు పెద్ద ప్రతిస్పందన లేకుండా. ఈ రోగి 5-అజాసిటిడిన్ చికిత్సలో క్లోనల్ కూర్పులో మార్పుతో, ఒక శాఖల పరిణామ నమూనాను చూపిస్తుంది. నిలువు గీతల పంక్తులు పరిశోధించిన నమూనా క్షణాలను సూచిస్తాయి. త్రిభుజంతో సూచించిన నమూనాలను WES విశ్లేషించింది. తదనంతరం, అన్ని నమూనాలను లక్ష్యంగా చేసుకున్న లోతైన సీక్వెన్సింగ్‌తో విశ్లేషించారు. ముఖ్యమైన జన్యుపరమైన ఉల్లంఘనలు మాత్రమే సూచించబడతాయి; జన్యుపరమైన ఉల్లంఘనల యొక్క పూర్తి జాబితాను అనుబంధ అత్తి 3 మరియు 4, అనుబంధ పట్టిక 3 మరియు అనుబంధ డేటా 1 మరియు 2. పిసిడి, పెంటాక్సిఫైలైన్, సిప్రోఫ్లోక్సాసిన్ మరియు డెక్సామెథాసోన్లలో చూడవచ్చు.

పూర్తి పరిమాణ చిత్రం

సహాయక సంరక్షణతో చికిత్స పొందిన రోగులలో క్లోనల్ పరిణామం

ఆరుగురు రోగులకు సహాయక సంరక్షణతో మాత్రమే చికిత్స అందించారు, ఇందులో రక్తమార్పిడి మరియు పెరుగుదల కారకాలు (ఎరిథ్రోపోయిసిస్-స్టిమ్యులేటింగ్ ఏజెంట్లు, గ్రాన్యులోసైట్ కాలనీ-స్టిమ్యులేటింగ్ ఫ్యాక్టర్ మరియు థ్రోంబోపోయిటిన్ రిసెప్టర్ అగోనిస్ట్) ఉన్నాయి. ఈ రోగులలో (యుపిఎన్ 04), ఎమ్‌డిఎస్ కణాల యొక్క ఒక క్లోన్ మాత్రమే గమనించబడింది, పునరావృత పరివర్తన చెందిన జన్యువులలో 3 ఉత్పరివర్తనాలతో సహా 12 ఉత్పరివర్తనలు ఉన్నాయి: ఒక జెడ్‌ఆర్‌ఎస్ఆర్ 2 మ్యుటేషన్ మరియు టిఇటి 2 లో రెండు వేర్వేరు ఉత్పరివర్తనలు (సప్లిమెంటరీ డేటా 1 మరియు సప్లిమెంటరీ ఫిగ్ 3). ఈ క్లోన్ చేత చేయబడిన ఉత్పరివర్తనాల సమితి 8 సంవత్సరాల మొత్తం పరిశీలనా కాలంలో మారలేదు, ఈ సమయంలో రోగి యొక్క క్లినికల్ పరిస్థితి స్థిరంగా ఉంది (Fig. 2a).

ఇద్దరు రోగులు (యుపిఎన్ 06 మరియు యుపిఎన్ 11) ఒక సరళ పరిణామ నమూనాను చూపించారు, దీనిలో వరుస క్లోన్లు, ఎక్కువ సంఖ్యలో ఉత్పరివర్తనాలను కలిగి ఉన్నాయి, వారి పూర్వీకుల క్లోన్లను అధిగమించాయి (Fig. 2b, c). రెండు సందర్భాల్లో, NRAS లో ఒక మ్యుటేషన్‌ను కలిగి ఉన్న క్లోన్ యొక్క ఆవిర్భావం మరియు విస్తరణకు అనుగుణంగా, రోగి ల్యూకోసైటోసిస్‌ను అభివృద్ధి చేశాడు (రెండూ> 100 × 10 9 / l, చివరిసారి పాయింట్ తర్వాత UPN06 కోసం) మరియు వ్యాధి యొక్క పురోగతి: UPN11 RCMD నుండి అభివృద్ధి చెందింది (మల్టీలినేజ్ డైస్ప్లాసియాతో వక్రీభవన సైటోపెనియా) నుండి RAEB-1 (అదనపు పేలుళ్లు -1 తో వక్రీభవన రక్తహీనత) మరియు చివరికి అభివృద్ధి చెందిన ద్వితీయ AML (sAML) (Fig. 2b), అయితే UPN06 RARS (రింగ్డ్ సైడెరోబ్లాస్ట్‌లతో వక్రీభవన రక్తహీనత) నుండి RAEB-2 వైపు అభివృద్ధి చెందింది. (Fig. 2 సి).

వ్యాధిని సవరించే చికిత్స తీసుకోని మిగతా ముగ్గురు రోగులు మరింత సంక్లిష్టమైన, శాఖల క్లోనల్ పరిణామ నమూనాలను చూపించారు. UPN03 (Fig. 2d) లో, ఒక సాధారణ పూర్వీకుల క్లోన్ నుండి రెండు విభిన్న ఉపక్లోన్లు ఉద్భవించాయి. జన్యు పరిణామం ఉన్నప్పటికీ, రోగి యొక్క క్లినికల్ పరిస్థితి 8 సంవత్సరాల ఫాలో-అప్‌లో గణనీయంగా అభివృద్ధి చెందలేదు. చివరికి, ఈ రోగి ప్రోస్టేట్ క్యాన్సర్‌తో మరణించాడు. బ్రాంచింగ్ పరిణామ నమూనాలతో ఉన్న మరో ఇద్దరు రోగులు sAML (Fig. 2e, f) వైపు పురోగమిస్తారు. ఇద్దరు రోగులలో, RAS పాత్వే సభ్యులలో ఉత్పరివర్తనలు గమనించబడ్డాయి. రోగి UPN05 లో, KRAS- పరివర్తన చెందిన క్లోన్ ఉద్భవించింది. రోగి UPN07 లో, రెండు సబ్‌క్లోన్‌లు, ఒకటి NRAS మ్యుటేషన్ మరియు RRAS మ్యుటేషన్ మోస్తున్నది ఒక సాధారణ పూర్వీకుల క్లోన్ నుండి తీసుకోబడ్డాయి. మొదటి నమూనా సమయంలో NRAS- మ్యూటెడ్ క్లోన్ ఆధిపత్యం చెలాయించింది. కాలక్రమేణా, ఈ క్లోన్ క్రమంగా RRAS- మ్యూటేటెడ్ క్లోన్ యొక్క సబ్‌క్లోన్‌లచే అధిగమించబడింది, sAML కు అనుగుణమైన పురోగతితో.

లెనాలిడోమైడ్తో చికిత్స పొందిన రోగులలో క్లోనల్ పరిణామం

లెనాలిడోమైడ్ పొందిన ఐదుగురు రోగులను విశ్లేషించారు, వీరిలో నలుగురు క్రోమోజోమ్ 5q (Fig. 3) పై తొలగింపును చేపట్టారు. మొత్తం 5q− రోగులు లెనాలిడోమైడ్ (Fig. 3a-d) కు బాగా స్పందించారు, దీని ఫలితంగా పదనిర్మాణ మరియు సైటోజెనెటిక్ పూర్తి ఉపశమనం లభిస్తుంది. ఏదేమైనా, మొత్తం సంపాదించిన ఉత్పరివర్తనాల సమితిని పరిశీలిస్తున్నప్పుడు, ఈ నలుగురు రోగులు వారి క్లోనల్ పరిణామ విధానాలకు సంబంధించి గణనీయమైన తేడాలను చూపించారు. రోగి UPN01 (Fig. 3a) ప్రారంభంలో లెనాలిడోమైడ్కు చాలా మంచి స్పందన చూపించింది, మరియు MDS క్లోన్ ఎముక మజ్జ (BM) జనాభాలో 2% కు తగ్గించబడింది. ఈ స్పందన క్రమంగా లెనాలిడోమైడ్ చికిత్స సమయంలో కోల్పోయింది, ఎందుకంటే అదనపు హెటెరోజైగస్ RELN మరియు TP53 ఉత్పరివర్తనాలను మోసే అసలు క్లోన్ యొక్క వారసుడు నెమ్మదిగా విస్తరించాడు, హిమోగ్లోబిన్ స్థాయిలు క్రమంగా క్షీణించడంతో పాటు. TP53 ఉత్పరివర్తనలు లెనాలిడోమైడ్ నిరోధకత 15 తో సంబంధం కలిగి ఉంటాయి.

ఇతర మూడు 5q− రోగులలో, పూర్తి ఉపశమనం సమయంలో విభిన్నమైన, సంబంధం లేని క్లోనల్ జనాభా పెరిగింది. చికిత్సకు ముందు ఈ ఉద్భవిస్తున్న క్లోన్లను ఇప్పటికే తక్కువ స్థాయిలో గుర్తించగలిగారు (Fig. 3 మరియు అనుబంధ డేటా 3). UPN08 మరియు UPN09 (Fig. 3b, c) లలో, లెనాలిడోమైడ్ చికిత్స ప్రారంభానికి ముందు హేమాటోపోయిసిస్‌ను ఆధిపత్యం చేసిన MDS క్లోన్లు చికిత్సలో ఎముక మజ్జ జనాభాలో వరుసగా 0.2% మరియు 2% కు తగ్గాయి (అనుబంధ డేటా 2 మరియు అనుబంధ అత్తి 3 మరియు 4 ). అయితే, ఇద్దరు రోగులలో, జన్యుపరంగా విభిన్నమైన క్లోన్ ఉద్భవించింది. ఈ విస్తరిస్తున్న క్లోన్‌లు గతంలో గుర్తించిన ఆధిపత్య క్లోన్లలో కనిపించే ఉత్పరివర్తనాలను కలిగి ఉండవని నిర్ధారించడానికి, మేము కాలనీ పరీక్షలు (CFU-GEMM (కాలనీ-ఏర్పడే యూనిట్-గ్రాన్యులోసైట్, ఎరిథ్రోసైట్, మోనోసైట్ మరియు మెగాకార్యోసైట్)) ప్రదర్శించాము, తరువాత వ్యక్తిగతంగా క్రమం. ఎంచుకున్న కాలనీలు. పెరుగుతున్న క్లోన్లు గతంలో ఉన్న ఉత్పరివర్తనాలను కలిగి ఉండవని ఇది చూపించింది (Fig. 4). ఇద్దరు రోగులలో, డెల్ (5 క్యూ) కలిగి ఉన్న క్లోన్లను లెనాలిడోమైడ్ బలంగా అణచివేసింది, కానీ పూర్తిగా నిర్మూలించబడలేదు. ఉదాహరణకు, UPN08 లో, లెనాలిడోమైడ్ చికిత్స ప్రారంభానికి ముందు ఉన్న అన్ని క్లోన్లను అణిచివేసేందుకు కనిపించింది (ఇతరులలో, CSNK1A1 మ్యుటేషన్ కలిగి ఉంది), అయితే చికిత్స సమయంలో ∼ 0.4% కణాలలో ఉత్పరివర్తనలు గుర్తించబడతాయి (అనుబంధ Fig. 5) .

Image

ఒకే కణంలో ఏ ఉత్పరివర్తనలు కలిసి ఉన్నాయో గుర్తించడానికి మరియు సంబంధం లేని క్లోన్ల నుండి కణాలు MDS క్లోన్‌లో ఉన్న ఏ పూర్వీకుల ఉత్పరివర్తనాలను కలిగి ఉండవని నిర్ధారించడానికి, మేము సింగిల్-సెల్-ఉత్పన్నమైన CFU-GEMM కాలనీలలో సీక్వెన్సింగ్ చేశాము. ప్రతి (ఉప) క్లోన్ నుండి ప్రతినిధి ఉత్పరివర్తనలు క్రమం చేయబడతాయి. ( ) యుపిఎన్ 08: సంబంధం లేని క్లోన్‌తో అనుసంధానించబడిన రెండు ఉత్పరివర్తనాలను కలిగి ఉన్న కాలనీలు మాత్రమే ఈ సమయంలో కనిపిస్తాయి. MDS క్లోన్ నుండి పరిశోధించిన రెండు ఉత్పరివర్తనలు ఈ కాలనీలలో లేవు. ( బి ) UPN09: చాలా కాలనీలు సంబంధం లేని ప్రధాన క్లోన్‌కు అనుగుణమైన EIF3L మ్యుటేషన్‌ను మాత్రమే కలిగి ఉంటాయి. రెండు కాలనీలు అదనపు సంబంధం లేని క్లోన్ యొక్క వారసుడికి అనుగుణమైన అదనపు CHRM2 మ్యుటేషన్‌ను కలిగి ఉన్నాయి. MDS క్లోన్ నుండి ఉత్పరివర్తనలు ఈ కాలనీలలో లేవు. ( సి ) యుపిఎన్ 10: జెఎకె 2 క్లోన్ అనేది స్వతంత్ర ఎమ్‌డిఎస్ క్లోన్ నుండి ఉత్పరివర్తనాలను కలిగి లేని స్వతంత్ర క్లోన్. ఇంకా, ఈ విశ్లేషణ LRRC34 ప్రధాన MDS క్లోన్ యొక్క వారసుడని నిర్ధారిస్తుంది, తరువాత ఇది MLL2 మ్యుటేషన్‌ను కూడా పొందింది. FRMD8 , OCA2 మరియు PRPS1L1 లోని ఉత్పరివర్తనలు LRRC34 మరియు MLL2 ఉత్పరివర్తనాలతో ఎప్పుడూ కలిసి ఉండవు , ఇవి ప్రత్యేక క్లోన్ అని సూచిస్తాయి. FRMD8 మ్యుటేషన్ OCA2 మరియు PRPS1L1 ల సముపార్జన కంటే తరువాతి సంఘటనగా కనిపిస్తుంది. మ్యుటేషన్ లేకపోవడం (VAF 40%) అంజీర్ 3 లోని క్లోన్లకు అనుగుణంగా ఉండే రంగుతో సూచించబడుతుంది.

పూర్తి పరిమాణ చిత్రం

అదనంగా, మిగిలిన 5q− రోగి, UPN10 (Fig. 3d) లో, పూర్తి ఉపశమనం సమయంలో క్లోనల్ జనాభా ఇప్పటికీ గుర్తించదగినది. లెనాలిడోమైడ్ చికిత్సలో, మోనోసమీ 7 (Fig. 3d, ఎరుపు మరియు ముదురు ఆకుపచ్చ క్లోన్) తో లేదా లేకుండా 5q− మరియు 8 ఇతర ఉత్పరివర్తనాలను కలిగి ఉన్న కణాలు బలంగా అణచివేయబడ్డాయి, కాని 5q- తొలగించని పూర్వీకుల క్లోన్ (ముదురు నీలం క్లోన్, Fig. 3d ) 6 ఉత్పరివర్తనాలను కలిగి ఉంది. లెనాలిడోమైడ్ చికిత్సలో, ఈ పూర్వీకుల MDS క్లోన్ నుండి తీసుకోబడిన సబ్‌క్లోన్లు కాలక్రమేణా విస్తరించాయి. అదనంగా, క్లోన్ కలిగిన JAK2 V617F లెనాలిడోమైడ్ చికిత్సలో విస్తరించింది (Fig. 3d మరియు అనుబంధ Fig. 4). సింగిల్-సెల్-ఉత్పన్న కాలనీల సీక్వెన్సింగ్, ఈ JAK2 మ్యుటేషన్‌ను కలిగి ఉన్న కణాలు ఇతర సబ్‌క్లోన్‌లలో ఉన్న ఉత్పరివర్తనాలను ఎప్పుడూ కలిగి ఉండవని చూపించింది, ఇది JAK2- మ్యూటెడ్ కణాలు ప్రత్యేకమైన, సంబంధం లేని క్లోన్‌ను సూచిస్తాయని సూచిస్తుంది (Fig. 4). 4.5 సంవత్సరాల చికిత్స తరువాత, రోగి లెనాలిడోమైడ్కు ప్రతిస్పందనను కోల్పోయాడు: హిమోగ్లోబిన్ స్థాయిలు క్రమంగా క్షీణించాయి మరియు లెనాలిడోమైడ్ కింద అణచివేయబడిన 5q− క్లోన్ నెమ్మదిగా విస్తరించింది. క్లినికల్ డిసీజ్ పురోగతి కారణంగా, లెనాలిడోమైడ్ చికిత్స ఆపివేయబడింది మరియు రోగి అలోజెనిక్ స్టెమ్ సెల్ మార్పిడికి గురయ్యాడు. పర్యవసానంగా, సిటు హైబ్రిడైజేషన్ (ఫిష్) విశ్లేషణలో సైటోజెనెటిక్ మరియు ఫ్లోరోసెన్స్ ద్వారా ఒక సంవత్సరానికి పైగా MDS కణాలు గుర్తించబడలేదు, అయినప్పటికీ కొన్ని రోగి-ఉత్పన్న రక్త కణాలను పరిమాణాత్మక దాత-గ్రహీత చిమెరిజం విశ్లేషణ (<1%, అనుబంధ అత్తి . 6). మార్పిడి చేసిన 19 నెలల తరువాత, ఈ రోగిలో క్లినికల్ పున pse స్థితి నిర్ధారణ అయింది, డెల్ (5 క్యూ)-క్లోన్ కలిగి ఉన్న తిరిగి కనిపించడంతో. 72 MDS డ్రైవర్ జన్యువుల ప్యానెల్ యొక్క టార్గెటెడ్ సీక్వెన్సింగ్ పున rela స్థితి సమయంలో అదనపు ఉత్పరివర్తనలు లేవు. అయినప్పటికీ, మార్పిడి చేసిన 39 నెలల తరువాత, MDS RAEB-1 కు చేరుకుంది మరియు అదనపు కార్యోటైపిక్ అసాధారణతలు మరియు CUX1 మ్యుటేషన్ గమనించబడ్డాయి. పున pse స్థితి తరువాత, రోగికి 5-అజాసిటిడిన్‌తో 8 నెలలు చికిత్స చేశారు, ఇది క్లోన్ పరిమాణం తగ్గడానికి దారితీసింది (Fig. 3d) హిమోగ్లోబ్లిన్ స్థాయిల మెరుగుదలతో పాటు.

డెల్ (5q) (UPN02, Fig. 3e) లేని రోగికి 16 నెలలు లెనాలిడోమైడ్ వచ్చింది మరియు స్థిరమైన వ్యాధి ఉంది. లెనాలిడోమైడ్ చికిత్సను నిలిపివేసిన తరువాత, రోగి 1 సంవత్సరానికి 5-అజాసిటిడిన్ అందుకున్నాడు, ఫలితంగా రక్తమార్పిడి పౌన .పున్యంలో అస్థిరమైన తగ్గుదల ఏర్పడింది. ఈ చికిత్సలో EZH2 లోని ఒక మ్యుటేషన్‌తో సహా అనేక ఉత్పరివర్తనాలను కలిగి ఉన్న సబ్‌క్లోన్, 5-అజాసిటిడిన్ చికిత్స ప్రారంభానికి ముందు ఆధిపత్యం వహించిన సబ్‌క్లోన్ యొక్క వ్యయంతో విస్తరించింది ( SF3B1 మరియు CUX1 మ్యుటేషన్ కలిగి ఉంటుంది). ఆసక్తికరంగా, 5-అజాసిటిడిన్ చికిత్స ఆగిపోయిన తరువాత, EZH2- మ్యూటేటెడ్ క్లోన్ అదృశ్యమైంది, SF3B1 - మరియు CUX1- మ్యూటేటెడ్ క్లోన్ యొక్క పున exp విస్తరణతో.

వేర్వేరు PB మరియు BM సెల్ భిన్నాలలో క్లోనల్ కూర్పు

MDS లో, BM కాండం మరియు పుట్టుకతో వచ్చిన కణాల నుండి పరిపక్వ రక్త కణాల ఉత్పత్తి చెదిరిపోతుంది, కానీ పూర్తిగా రద్దు చేయబడదు. సిద్ధాంతంలో, పరిపక్వత యొక్క వివిధ దశలలో BM కణాలలో వేర్వేరు ఉత్పరివర్తనలు సంభవించవచ్చు. అదనంగా, నిర్దిష్ట ఉత్పరివర్తనలు ఒక నిర్దిష్ట దశలో పరిపక్వతను నిరోధించవచ్చు, అయితే ఇతరులు పరిపక్వతను పూర్తిగా పరిపక్వ రక్త కణాల వరకు అనుమతించవచ్చు. తత్ఫలితంగా, రోగిలోని వివిధ పుట్టుకతో వచ్చిన కణ భిన్నాలు మరియు పరిపక్వ దశల కణాలలో విభిన్న పరస్పర ప్రకృతి దృశ్యాలు గమనించవచ్చు. దీనిని అధ్యయనం చేయడానికి, మేము ఆరు BM రోగుల (UPN01, 03, 04, 05, 06) వివిధ BM కాండం (హేమాటోపోయిటిక్ మూల కణాలు (HSC లు)) మరియు పుట్టుకతో వచ్చిన భిన్నాలు (కామన్ మైలోయిడ్ ప్రొజెనిటర్, గ్రాన్యులోసైట్-మాక్రోఫేజ్ ప్రొజెనిటర్ మరియు మెగాకార్యోసైట్-ఎరిథ్రాయిడ్ ప్రొజెనిటర్) నుండి DNA ను వేరుచేసాము. మరియు 10) వారి వ్యాధి సమయంలో అనేక సమయాలలో. కణాల సమూహంలో కనుగొనబడిన అన్ని ఉత్పరివర్తనలు అన్ని విశ్లేషించబడిన కాండం మరియు పుట్టుకతో వచ్చిన భిన్నాలలో కూడా కనుగొనబడ్డాయి, అయినప్పటికీ కొన్నిసార్లు వివిధ కణ భిన్నాలలో కొంత భిన్నమైన VAF తో (Fig. 5 మరియు అనుబంధ అత్తి 7-9). అదనంగా, వ్యాధి సమయంలో తరువాత తలెత్తిన ఉత్పరివర్తనలు, సబ్‌క్లోన్‌లను అభివృద్ధి చేయటానికి లక్షణం, అన్ని కాండం మరియు పుట్టుకతో వచ్చిన కణ భిన్నాలలో సుమారు సమాన పౌన .పున్యాల వద్ద ఉన్నాయి. ప్రారంభ మరియు చివరి ఉత్పరివర్తనలు రెండూ ప్రారంభ హెచ్‌ఎస్‌సిలలో ఉద్భవించాయని ఇది సూచిస్తుంది, ఇవి ఇప్పటికీ వేర్వేరు మైలోయిడ్ వంశాలుగా విభజించగల సామర్థ్యాన్ని కలిగి ఉంటాయి. అదనంగా, BM మరియు పరిధీయ రక్తం (PB) నమూనాలలో పరస్పర భారం చాలా పోల్చదగినది (అనుబంధ అత్తి 10-16). సాధారణంగా, VAF లు PB లో కొంత తక్కువగా ఉండేవి, అధిక శాతం లింఫోయిడ్ కణాల వల్ల కావచ్చు. పిబి గ్రాన్యులోసైట్ భిన్నం బిఎమ్ నమూనాలతో పోల్చదగిన పరస్పర భారాన్ని ప్రదర్శించింది, పరివర్తన చెందిన మరియు నాన్‌మ్యుటేటెడ్ మైలోయిడ్ ప్రొజెనిటర్ కణాలు పరిపక్వ గ్రాన్యులోసైట్‌లను రూపొందించడానికి ఇలాంటి సామర్థ్యాన్ని కలిగి ఉన్నాయని సూచిస్తుంది.

Image

తగినంత పదార్థం కలిగిన ఆరుగురు MDS రోగుల నుండి (UPN01, 03, 04, 05, 06 మరియు 10), మేము వివిధ ఎముక మజ్జ కాండం మరియు పుట్టుకతో వచ్చిన కణ భిన్నాలను వివిధ సమయ బిందువుల వద్ద క్రమబద్ధీకరించాము. కణితి భారం యొక్క కొన్ని చిన్న తేడాలు వివిధ భిన్నాల మధ్య గమనించబడతాయి. బిఎల్, బేస్లైన్; HSC, హేమాటోపోయిటిక్ మూలకణం; CMP, కామన్ మైలోయిడ్ ప్రొజెనిటర్; GMP, గ్రాన్యులోసైట్-మాక్రోఫేజ్ ప్రొజెనిటర్; MEP, మెగాకార్యోసైట్-ఎరిథ్రాయిడ్ ప్రొజెనిటర్.

పూర్తి పరిమాణ చిత్రం

చర్చా

సహాయక సంరక్షణ పొందుతున్న MDS రోగులలో, అలాగే లెనాలిడోమైడ్తో చికిత్స పొందిన రోగులలో మేము పరస్పర స్పెక్ట్రం మరియు క్లోనల్ పరిణామాన్ని అధ్యయనం చేసాము. ఒక క్లోన్ పరిణామం యొక్క అనేక నమూనాలు ఒకే క్లోన్ ఉన్న రోగి నుండి చాలా సంవత్సరాలు స్థిరంగా ఉండి, క్లోనల్ కూర్పులో అధిక డైనమిక్ మార్పులతో ఉన్న రోగుల వరకు గమనించబడ్డాయి. చికిత్స క్లోనల్ పరిణామాన్ని ప్రభావితం చేస్తుందని మరియు చికిత్సలో MDS- సంబంధం లేని క్లోన్లు తలెత్తవచ్చని మేము ధృవీకరించాము. లెనాలిడోమైడ్తో చికిత్స పొందిన రోగులలో మరియు సహాయక సంరక్షణతో చికిత్స పొందిన రోగులలో క్లోనల్ పరిణామం గమనించబడింది. సహాయక సంరక్షణ సమూహంలోని చాలా మంది రోగులు పరిణామ నమూనాను ప్రభావితం చేసిన హేమాటోపోయిసిస్‌ను ప్రేరేపించడానికి వృద్ధి కారకాలను పొందారు, కాని మేము పరిమిత సంఖ్యలో రోగులను మాత్రమే విశ్లేషించినందున, మేము ఎటువంటి తీర్మానాలను తీసుకోలేము. వృద్ధి కారకాలతో చికిత్స పొందిన ముగ్గురు రోగులు చివరికి sAML (UPN05, 07 మరియు 11) కు చేరుకున్నారు. ముగ్గురు రోగులలో, చివరికి sAML గా అభివృద్ధి చెందిన క్లోన్లలో RAS కుటుంబ సభ్యులలో ఒకరిలో ఒక భిన్నమైన మ్యుటేషన్ ఉంది. రోగి UPN05 మరియు UPN11 వరుసగా NRAS మరియు KRAS లలో ఒక మ్యుటేషన్‌ను పొందాయి, SAML నిర్ధారణకు కొన్ని నెలల ముందు దీనిని కనుగొనవచ్చు. UPN07 లో, RAS పాత్వే ( NRAS మరియు RRAS ) లోని ఇద్దరు సభ్యులు ప్రత్యేక సబ్‌క్లోన్‌లలో పరివర్తన చెందారు. RRAS ఉత్పరివర్తనలు తరచూ హేమాటోలాజికల్ ప్రాణాంతకతలో కనుగొనబడవు, కానీ కొన్ని సందర్భాలు 16 వివరించబడ్డాయి. బాల్య మైలోమోనోసైటిక్ లుకేమియా ఉన్న ఒక రోగి ప్రత్యేక క్లోన్లలో ఒక NRAS మరియు RRAS మ్యుటేషన్‌ను కూడా తీసుకువెళ్ళినట్లు నివేదించబడింది, అయితే కెమోథెరపీ తర్వాత RRAS- పరివర్తన చెందిన క్లోన్ మాత్రమే మిగిలి ఉంది. UPN07 లో, NRAS మ్యుటేషన్ ఉన్న ప్రారంభ ప్రధాన క్లోన్ కాలక్రమేణా RRAS- పరివర్తన చెందిన క్లోన్ చేత అధిగమించబడింది. క్లోనల్ కూర్పులో ఈ మార్పు సమయంలో, ఎరిథ్రోపోయిసిస్-స్టిమ్యులేటింగ్ ఏజెంట్ తప్ప వేరే చికిత్స ఇవ్వబడలేదు. మునుపటి నివేదికలు SAML 17, 18, 19, 20 వైపు విస్తరణ మరియు పురోగతిని పెంచడంలో RAS ఉత్పరివర్తనాలను సూచించాయి . మా డేటాతో కలిపి, RAS కుటుంబ సభ్యులలో ఉత్పరివర్తనాల కోసం స్క్రీనింగ్ MDS లో అవసరమని ఇది సూచిస్తుంది, ఎందుకంటే ఈ ఉత్పరివర్తనాల సముపార్జన మరింత దూకుడుగా ఉండే క్లోన్‌ల అభివృద్ధితో పరస్పర సంబంధం కలిగి ఉన్నట్లు అనిపిస్తుంది, చివరికి ఇది SAML వైపు పురోగతికి దారితీస్తుంది. అంతిమంగా, RAS ఉత్పరివర్తనలు పొందిన రోగులు RAS మార్గాన్ని లేదా MEK ఇన్హిబిటర్స్ 21 వంటి దాని దిగువ సిగ్నలింగ్ భాగస్వాములను లక్ష్యంగా చేసుకునే నిర్దిష్ట రకాల చికిత్సల కోసం అభ్యర్థులు కావచ్చు.

5q తొలగింపును కలిగి ఉన్న రోగులలో లెనాలిడోమైడ్ యొక్క ప్రయోజనకరమైన ప్రభావం వెనుక ఉన్న విధానం ఇటీవల 22 వివరించబడింది. లెనాలిడోమైడ్ అపోప్టోసిస్‌కు దారితీసే CSNK1A1 యొక్క అధోకరణాన్ని ప్రేరేపిస్తుంది. 5q తొలగింపును కలిగి ఉన్న MDS కణాలు ఒకే ఒక CSNK1A1 యుగ్మ వికల్పం మాత్రమే కలిగి ఉంటాయి మరియు అందువల్ల లెనాలిడోమైడ్‌కు మరింత సున్నితమైనవిగా భావిస్తారు. చాలా మంది రోగులు చివరికి చికిత్సకు ప్రతిఘటనను అభివృద్ధి చేస్తారు, ఇది తరచూ TP53 ఉత్పరివర్తనలు 15, 23 ను పొందుతుంది . రోగి UPN01 ప్రారంభంలో లెనాలిడోమైడ్‌కు అద్భుతమైన క్లినికల్ మరియు మాలిక్యులర్ స్పందనను చూపించింది, అయితే క్రమంగా ఒక సబ్‌క్లోన్ విస్తరించింది, ఇది TP53 లో ఒక మ్యుటేషన్‌ను పొందింది. లెనాలిడోమైడ్ (0.2% ప్రవేశంలో) చికిత్సకు ముందు ఈ మ్యుటేషన్ కనుగొనబడలేదు. లెనాలిడోమైడ్ కింద TP53- మ్యుటేటెడ్ కణాల పెరుగుదల గణనీయమైన సమయం తీసుకుంది, కాని చివరికి రోగి క్లినికల్ లక్షణాల పునరావృతతను అనుభవించాడు. నిరంతర చికిత్స కంటే లెనాలిడోమైడ్‌తో అడపాదడపా చికిత్స ఎక్కువ ప్రయోజనకరంగా ఉందా అని మాత్రమే మేము can హించగలము (అసలు TP53- నెగటివ్ క్లోన్‌ను అణచివేయడానికి సరిపోతుంది, TP53- పాజిటివ్ కణాల ఎంపికను నిలిపివేస్తుంది), లేదా హానికరమైనది ( TP53 ప్రతికూల మరియు రెండింటినీ అనుమతిస్తుంది) సానుకూల MDS కణాలు పెరగడానికి). మొదటి అవకాశం విషయంలో, లెనాలిడోమైడ్ సున్నితత్వం ఎక్కువ కాలం పాటు భద్రపరచబడి ఉండవచ్చు, కానీ దీనిని పరిష్కరించడానికి, భవిష్యత్తులో క్లినికల్ టెస్టింగ్ అవసరం.

CSNK1A1 లో UPN08 ఒక మ్యుటేషన్‌ను కలిగి ఉంది, ఇది 5–18% రోగులలో 5q తొలగింపు 24, 25, 26 తో పరివర్తన చెందినట్లు వివరించబడింది . ఈ ఉత్పరివర్తనాల యొక్క ఖచ్చితమైన జీవ పాత్ర ఇంకా పరిశోధనలో ఉన్నప్పటికీ, CSNK1A1 వైల్డ్-టైప్ 5q− రోగులతో 24, 25 తో పోలిస్తే లెనాలిడోమైడ్కు తగ్గిన ప్రతిస్పందన మరియు మొత్తం మనుగడ తగ్గినట్లు ఇప్పటివరకు నివేదికలు చూపించాయి. దీనికి విరుద్ధంగా, యుపిఎన్ 08 లెనాలిడోమైడ్‌కు క్లినికల్ మరియు సైటోజెనెటిక్ కంప్లీట్ రిమిషన్‌తో ఇప్పటికే 8 సంవత్సరాలకు పైగా నిర్వహించబడుతోంది, ఇది ఇంతకు ముందు వివరించబడని ఈ రోగిలో కనుగొనబడిన నిర్దిష్ట మ్యుటేషన్ (జి 24 ఆర్) కు సంబంధించినది కావచ్చు.

లెనాలిడోమైడ్తో చికిత్స పొందిన ఐదుగురు రోగులలో, మొత్తం క్లోన్ పరిమాణంలో గణనీయమైన తగ్గింపు గమనించబడింది. ఆసక్తికరంగా, ప్రతిస్పందించే ముగ్గురు రోగులలో, ముందుగా ఉన్న, చిన్న క్లోనల్ జనాభా MDS కణాలతో పంచుకోని ఉత్పరివర్తనాలను కలిగి ఉంది, MDS కణాల సంఖ్య తగ్గిన తరువాత పెరిగింది. ఈ రోగులలో, వ్యాధిని తగ్గించే చికిత్స యొక్క పరిణామం ఒక పరిణామ అడ్డంకిని సృష్టించి ఉండవచ్చు, ఆ తరువాత పరిమిత సంఖ్యలో హెచ్‌ఎస్‌సిల ద్వారా పున op ప్రారంభం సంభవించి ఉండవచ్చు. AML 27 లో ఇండక్షన్ కెమోథెరపీ తర్వాత ఇలాంటి పరిశీలనలు ఇటీవల వివరించబడ్డాయి. అనేక దృశ్యాలు సంభవించవచ్చని డేటా సూచిస్తుంది. MDS క్లోన్ యొక్క చికిత్సా తగ్గింపు తరువాత, అనిశ్చిత సంభావ్యత యొక్క క్లోనల్ హేమాటోపోయిసిస్‌ను పోలి ఉండే ఒక నమూనాను గమనించవచ్చు, కణాల క్లోనల్ విస్తరణతో తెలిసిన డ్రైవర్ మ్యుటేషన్ (యుపిఎన్ 08 లాగా) 28, 29, 30 . ఇంకా, అసలు MDS క్లోన్ యొక్క తగ్గింపు బాగా తెలిసిన డ్రైవర్ మ్యుటేషన్లను కలిగి ఉన్న ముందుగా ఉన్న కణాల పెరుగుదలకు స్థలాన్ని సృష్టించవచ్చు. రోగి యుపిఎన్ 10 మాదిరిగానే, చికిత్స తర్వాత ఎముక మజ్జ యొక్క పున ol స్థాపన సమయంలో ఇది వృద్ధి ప్రయోజనానికి దారితీయవచ్చు, వీరిలో ఒక JAK2- పరివర్తన చెందిన క్లోన్ విస్తరించింది, ఇది 20% క్లోన్ పరిమాణానికి మించి పురోగతి సాధించలేదు మరియు మరింత జన్యు పరిణామానికి గురికాదు. చివరగా, మరింత విస్తరణ మరియు జన్యుపరంగా అస్థిర క్లోన్లు పెరిగే అవకాశం ఉంది (రోగి UPN09 లాగా) ఇది ఇప్పటికీ ప్రారంభ MDS క్లోన్ నుండి ఉద్భవించి ఉండవచ్చు, కాని దీనిలో ప్రారంభ సాధారణ మ్యుటేషన్ తప్పిపోయింది. ప్రత్యామ్నాయంగా, ఈ కణాలు రెండవ డి నోవో MDS ను సూచిస్తాయి.

4.5 సంవత్సరాల చికిత్స తరువాత, యుపిఎన్ 10 క్రమంగా లెనాలిడోమైడ్కు ప్రతిస్పందనను కోల్పోయింది మరియు అలోజెనిక్ స్టెమ్ సెల్ మార్పిడికి గురైంది. మార్పిడి చేసిన 19 నెలల తరువాత, డెల్ (5 క్యూ) క్లోన్లలో ఒకటి క్లినికల్ పున rela స్థితితో పాటు విస్తరించింది. ఆసక్తికరంగా, ఈ క్లోన్ జన్యుపరంగా క్లోన్లలో ఒకదానికి సమానంగా ఉంటుంది, ఇది మొదట లెనాలిడోమైడ్కు బాగా స్పందించింది. అందువల్ల, పున ps స్థితి క్లోన్ లెనాలిడోమైడ్ సున్నితమైనది కావచ్చు మరియు చికిత్సను పున art ప్రారంభించడం చెల్లుబాటు అయ్యే ఎంపిక కావచ్చు.

ఇద్దరు రోగులకు (యుపిఎన్ 02 మరియు యుపిఎన్ 10) 5-అజాసిటిడిన్‌తో చికిత్స అందించారు. UPN02 లో, 5-అజాసిటిడిన్ చికిత్సలో ప్రధాన క్లోన్ తగ్గింది, అయితే EZH2 మ్యుటేషన్ కలిగిన సబ్‌క్లోన్ విస్తరించింది. 5-అజాసిటిడిన్ చికిత్స ఆగిపోయిన తరువాత, EZH2- మ్యూటేటెడ్ సబ్‌క్లోన్ తగ్గిపోయి గుర్తించబడలేదు, ఇది EZH2- మ్యూటేటెడ్ సబ్‌క్లోన్ వృద్ధి ప్రయోజనాన్ని కలిగి ఉందని మరియు 5-అజాసిటిడిన్ చికిత్సలో ప్రధాన క్లోన్ తగ్గిపోయిందని సూచిస్తుంది. యుపిఎన్ 10 హిమోగ్లోబ్లిన్ స్థాయిల మెరుగుదల మరియు 5-అజాసిటిడిన్ చికిత్సపై క్లోన్ పరిమాణంలో తగ్గింపును చూపించింది. 8 చక్రాల తరువాత రోగి ఆమె పరిస్థితి సరిగా లేకపోవడంతో తదుపరి చికిత్సను నిరాకరించింది. 5-అజాసిటిడిన్ చికిత్సను నిలిపివేసిన తరువాత, MDS క్లోన్ తిరిగి విస్తరించింది. ఈ పరిశీలన మెర్లేవెడే మరియు ఇతరులు ఇటీవల ప్రచురించిన డేటాకు భిన్నంగా ఉంది. 31, దీనిలో హైపోమీథైలేటింగ్ ఏజెంట్లతో చికిత్స పొందిన దీర్ఘకాలిక మైలోమోనోసైటిక్ లుకేమియా రోగుల నుండి మోనోసైట్లలో క్లోన్ పరిమాణంలో తగ్గుదల కనిపించలేదు.

వివిధ కాండం మరియు పుట్టుకతో వచ్చిన భిన్నాలలో పరస్పర భారం యొక్క విశ్లేషణ సాధారణంగా, వివిధ కణ జనాభా మధ్య స్థూల తేడాలు కనిపించలేదని సూచిస్తుంది. వోల్ మరియు ఇతరులు నివేదించిన మూల కణ భిన్నాల విశ్లేషణకు అనుగుణంగా, ప్రారంభ మరియు చివరి MDS- అనుబంధ ఉత్పరివర్తనలు రెండూ వివిధ మైలోయిడ్ వంశాలలో వేరు చేయగల సామర్థ్యాన్ని కలిగి ఉన్న HSC లలో ఉద్భవించాయని ఇది సూచిస్తుంది. [13 ] అదనంగా, BM మరియు PB లలో పరస్పర భారం చాలా పోల్చదగినది. దీర్ఘకాలిక మైలోయిడ్ లుకేమియా రోగుల యొక్క పరిధీయ రక్తంలో BCR-ABL స్థాయిల పర్యవేక్షణతో పోల్చదగిన పరిధీయ రక్తం ఆధారంగా రోగుల యొక్క మరింత రోగి-స్నేహపూర్వక పర్యవేక్షణ బహుశా ఖచ్చితమైనదని ఇది సూచిస్తుంది.

మా అధ్యయనం వ్యాధి-సవరించే చికిత్సతో మరియు లేకుండా చికిత్స పొందిన MDS రోగులలో వివిధ క్లోనల్ పరిణామ నమూనాలను గమనించవచ్చు. వ్యాధి సమయంలో జన్యు ప్రకృతి దృశ్యాన్ని పర్యవేక్షించడం చికిత్స నిర్ణయాలకు మార్గనిర్దేశం చేస్తుంది.

పద్ధతులు

రోగి నమూనాలు

సుదీర్ఘ వ్యాధి కోర్సు (2.5–11 సంవత్సరాల ఫాలో-అప్, మధ్యస్థ 7) మరియు అనేక మాదిరి క్షణాలు (5–31, మధ్యస్థ 7) (టేబుల్ 1) ఆధారంగా పదకొండు MDS రోగులు (7 పురుషులు మరియు 4 స్త్రీలు) ఎంపికయ్యారు. రోగుల యొక్క రెండు వర్గాలు విశ్లేషించబడ్డాయి: సహాయక చికిత్స పొందిన రోగులు ( n = 6) మరియు లెనాలిడోమైడ్ ( n = 5) తో చికిత్స పొందిన రోగులు. తరువాతి సమూహంలోని ఇద్దరు రోగులకు 5-అజాసిటిడిన్ కూడా వచ్చింది. ఈ రోగుల నుండి బిఎమ్ మరియు పిబిలను బహుళ సమయ పాయింట్ల వద్ద పొందారు. హెల్సింకి డిక్లరేషన్ మరియు రాడ్‌బౌడమ్క్ నిజ్మెగెన్ (IRB నంబర్: CMO 2013/064) నుండి సంస్థాగత మార్గదర్శకాలు మరియు నిబంధనలకు అనుగుణంగా ఈ అధ్యయనం జరిగింది, మరియు రోగులందరికీ సమాచార సమ్మతి కూడా ఉంది. రోగి లక్షణాలు టేబుల్ 1 లో ఇవ్వబడ్డాయి. ప్రామాణిక మే-గ్రన్వాల్డ్-జీమ్సా మరకలను ఉపయోగించి BM కణాల స్వరూపాన్ని పరిశీలించారు.

DNA ఐసోలేషన్ మరియు యాంప్లిఫికేషన్

తయారీదారుల ప్రోటోకాల్ ప్రకారం న్యూక్లియోస్పిన్ బ్లడ్ క్విక్ ప్యూర్ కిట్ (మాచెరీ నాగెల్, డ్యూరెన్, జర్మనీ) ఉపయోగించి MDS రోగుల PB లేదా BM నుండి DNA వేరుచేయబడింది. అదనంగా, ఫికోల్ -1077 సాంద్రత ప్రవణత వేరు చేసిన తరువాత BM మరియు PB మోనోన్యూక్లియర్ కణాలు (MNC లు) మరియు PB గ్రాన్యులోసైట్లు పొందబడ్డాయి. ఫికోల్-పాక్ ప్లస్ (సాంద్రత 1.077) (జిఇ హెల్త్‌కేర్, చికాగో, ఐఎల్, యుఎస్‌ఎ) తో పొర పైన బిఎమ్ లేదా పిబి కణాలు నెమ్మదిగా జోడించబడ్డాయి. 20 నిమిషాలకు 700 గ్రాముల వద్ద సెంట్రిఫ్యూగేషన్ తరువాత, MNC లు ఫికాల్ పొర పైన మరియు గ్రాన్యులోసైట్లు (మరియు ఎర్ర రక్తాలు) క్రింద ఉన్నాయి. ఈ రెండు కణ భిన్నాలు విడిగా సేకరించబడ్డాయి, తరువాత DNA వేరుచేయబడింది. క్విబిట్ ఫ్లోరోమీటర్ క్వాంట్-ఐటి డిఎస్డిఎన్ఎ బిఆర్ అస్సే కిట్ (థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్, వాల్తామ్, ఎంఏ, యుఎస్ఎ) తో కొలిచినట్లుగా వెలికితీత దిగుబడి సరిపోదు (80 5), కియాజెన్ రెప్లి-జి కిట్ (80) తయారీదారుల ప్రోటోకాల్ ప్రకారం 4 సమాంతర ప్రతిచర్యలలో (ప్రతిచర్యకు 20 ng) కియాగెన్, వెన్లో, నెదర్లాండ్స్).

కార్యోటైప్ విశ్లేషణ

ఎముక మజ్జ నమూనాలను RPMI-1640 మాధ్యమంలో (లైఫ్ టెక్నాలజీస్, కార్ల్స్ బాడ్, CA, USA) 24-48 గం వరకు కల్చర్ చేశారు, ఇవి 10% పిండం దూడ సీరం మరియు యాంటీబయాటిక్స్ తో భర్తీ చేయబడ్డాయి. 0.075 M KCl తో హైపోటానిక్ చికిత్స మరియు మిథనాల్ / ఎసిటిక్ యాసిడ్ (3: 1) లో స్థిరీకరణ తరువాత, మైక్రోస్కోపిక్ స్లైడ్ సన్నాహాలు తయారు చేయబడ్డాయి. ట్రిప్సిన్ (లైఫ్ టెక్నాలజీస్) మరియు జిమ్సా ఉపయోగించి క్రోమోజోమ్‌లను జి-బ్యాండెడ్ చేశారు మరియు సాధారణ కార్యోటైప్ విషయంలో కనీసం 20 మెటాఫేజ్‌లను విశ్లేషించారు మరియు అసాధారణమైన కార్యోటైప్ విషయంలో కనీసం 10 మెటాఫేజ్‌లను విశ్లేషించారు. ప్రామాణిక ISCN 2013 నామకరణ వ్యవస్థ 34 ప్రకారం కార్యోటైప్‌లను వివరించారు.

సిటు హైబ్రిడైజేషన్‌లో ఫ్లోరోసెన్స్

ఫిష్ కోసం ప్రామాణిక సైటోజెనెటిక్ సెల్ సన్నాహాలు ఉపయోగించబడ్డాయి. తయారీదారు యొక్క స్పెసిఫికేషన్ల ప్రకారం (అబోట్ మాలిక్యులర్, డెస్ ప్లెయిన్స్, IL, USA) LSI EGR1 / D5S23D5S721, LSI IGH / MYC / CEP 8 మరియు D13s319 / 13q34 FISH కోసం వాణిజ్యపరంగా లభించే ప్రోబ్ కిట్‌లను ఉపయోగించి ఫిష్ ప్రదర్శించబడింది. కనీసం 200 ఇంటర్ఫేస్ న్యూక్లియీల ఫ్లోరోసెంట్ సిగ్నల్స్ ఇద్దరు స్వతంత్ర పరిశోధకులచే స్కోర్ చేయబడ్డాయి మరియు వివరించబడ్డాయి. నియంత్రణ కణజాలం నుండి ఫిష్ ఫలితాల గణాంక మూల్యాంకనం ద్వారా లాభాలు మరియు నష్టాలు రెండింటికీ కటాఫ్ విలువలు నిర్ణయించబడతాయి. ప్రతి ప్రోబ్ కోసం సగటు + 3 sd తప్పుడు పాజిటివ్ న్యూక్లియైలు కటాఫ్ స్థాయిగా తీసుకోబడ్డాయి.

టి-సెల్ సంస్కృతి

పిబి (లేదా బిఎమ్) నుండి టి కణాల విట్రో విస్తరణ ద్వారా ప్రతి రోగి నుండి స్వచ్ఛమైన టి కణాలు పొందబడ్డాయి. కణజాల సంస్కృతి ఫ్లాస్క్‌లకు కట్టుబడి మోనోసైట్లు మొదట క్షీణించాయి. మిగిలిన కణాలు 14 నుండి 21 రోజుల వరకు IMDM మాధ్యమంలో (లైఫ్ టెక్నాలజీస్) 10% మానవ సీరం (PAA లాబొరేటరీస్ GmbH, పాస్చింగ్, ఆస్ట్రియా), ఇంటర్‌లుకిన్ -2 (100 IU ml −1 ) మరియు CD3 / CD28- పూత కలిగిన డైనబెడ్స్‌తో భర్తీ చేయబడ్డాయి. (థర్మో ఫిషర్). టి కణాల స్వచ్ఛతను సిడి 3 ఉపరితల మార్కర్ ఉపయోగించి ఫ్లో సైటోమెట్రిక్ విశ్లేషణ ద్వారా కొలుస్తారు. టి కణాల స్వచ్ఛత 95% దాటినప్పుడు, న్యూక్లియోస్పిన్ బ్లడ్ క్విక్‌పుర్ కిట్‌ను ఉపయోగించి డిఎన్‌ఎ వేరుచేయబడింది.

మెసెన్చైమల్ స్ట్రోమల్ సెల్ కల్చర్

ఐదు సబ్జెక్టుల నుంచి ఎంఎస్‌సి లైన్లు రూపొందించబడ్డాయి. ఎముక మజ్జ MNC లను ఫికోల్ -1077 సాంద్రత ప్రవణత వేరుచేయడం ద్వారా పొందారు. BM-MNC లు ep-MEM మాధ్యమంలో (సిగ్మా-అల్డ్రిచ్, సెయింట్ లూయిస్, MO, USA) 8 నుండి 23 × 10 4 కణాల సెంటీమీటర్ల సాంద్రతతో హెపారిన్ (3.5 IU ml −1 ) మరియు 5% ప్లేట్‌లెట్‌తో భర్తీ చేయబడ్డాయి. lysate. ప్లేట్‌లెట్స్ ఫ్రీజ్-థావింగ్ (> మి.లీకి 0.8 × 10 9 ప్లేట్‌లెట్స్) ద్వారా ప్లేట్‌లెట్ లైసేట్ తయారు చేయబడింది, తరువాత 4, 700 గ్రాముల వద్ద సెంట్రిఫ్యూగేషన్ మరియు సూపర్‌నాటెంట్ సేకరణ. నాట్లు వేసిన 7 రోజులలో, సంస్కృతి మాధ్యమం రిఫ్రెష్ చేయబడింది. తదనంతరం, 80% సంగమం చేరుకున్నప్పుడు కణాలు ఆమోదించబడ్డాయి. 7 రోజుల సంస్కృతి తరువాత, అన్ని తేలియాడే మరియు చనిపోయిన కణాలు కొట్టుకుపోయాయి మరియు MSC లతో ఒక పొర మిగిలిపోయింది. MSC లు 5 భాగాల వరకు కల్చర్ చేయబడ్డాయి.

CFU-GEMM సంస్కృతి మరియు ఒకే కాలనీల క్రమం

పిబి-ఎంఎన్‌సిలు లేదా బిఎమ్-ఎంఎన్‌సిలను మిథైల్ సెల్యులోజ్ మీడియాలో (బిఎమ్‌కి మి.లీకి 10, 000–25, 000 కణాలు మరియు పిబికి 100, 000–200, 000 కణాలు) సీడ్ చేయబడ్డాయి, ఇందులో స్టెమ్ సెల్ కారకం, ఇంటర్‌లూకిన్ -3, గ్రాన్యులోసైట్-మాక్రోఫేజ్ కాలనీ-స్టిమ్యులేటింగ్ ఫ్యాక్టర్ మరియు ఎరిథ్రోపోయిటిన్ ( H4434; స్టెమ్ సెల్ టెక్నాలజీస్, వాంకోవర్, కెనడా) మరియు 5% CO 2 తో 37 ° C వద్ద 14 రోజులు పొదిగేది. 14 వ రోజు వ్యక్తిగత కాలనీలను సేకరించి, 96 బావుల పలకలో ఫాస్ఫేట్-బఫర్డ్ సెలైన్‌తో కడుగుతారు. 30 μl లైసిస్ బఫర్ (TE- బఫర్ + 0.5% ఇగేపాల్- CA630 + 0.6 proteinl ప్రోటీనేస్ K (10 mg ml −1 )) ను జోడించి కణాలు లైస్ చేయబడ్డాయి, తరువాత 120 నిమిషాలకు 56 ° C వద్ద మరియు 30 నిమిషాలకు 90 ° C వద్ద పొదిగేవి . తరువాత, ప్రతి పిసిఆర్ ప్రతిచర్యకు 1 μl లైసేట్ ఉపయోగించబడింది. దిగువ వివరించిన విధంగా టార్గెటెడ్ యాంప్లికాన్-ఆధారిత డీప్ సీక్వెన్సింగ్ ప్రదర్శించబడింది. మిశ్రమ కాలనీల ఫలితాలను నివేదించే అవకాశాన్ని మినహాయించడానికి, > 40% యొక్క VAF తో ఉత్పరివర్తనలు కనుగొనబడిన కాలనీలు మాత్రమే సానుకూలంగా నివేదించబడ్డాయి.

మైలోయిడ్ ప్రొజెనిటర్స్ యొక్క సార్టింగ్

1 ml ద్వారా స్తంభింపచేసిన ఎముక మజ్జ MNC లను 100 μl DNAse I (2 mg μl −1 ) సమక్షంలో కరిగించి, 1.6 ml పిండం దూడ సీరం, 10 μl హెపారిన్ (5, 000 U ml −1 ) మరియు 100 μl MgSO 4 (0.22 μM). తదనంతరం, పాంగ్ మరియు ఇతరుల నుండి స్వీకరించబడిన ప్రోటోకాల్ ప్రకారం మైలోయిడ్ ప్రొజెనిటర్ కణాలు క్రమబద్ధీకరించబడ్డాయి. CD34-APC (బెక్మాన్ కౌల్టర్, బ్రీ, CA, USA), CD38-PE-Cy7 (బయోలెజెండ్, శాన్ డియాగో, CA, USA), CD123-PE (బయోలెజెండ్) మరియు CD45RA-PB (బయోలెజెండ్) తో కణాలు కడిగి తడిసినవి. ) మోనోక్లోనల్ యాంటీబాడీస్. కణాలు FACS Aria SORP ఫ్లో సైటోమీటర్ మరియు DIVA సాఫ్ట్‌వేర్ (బెక్టన్ డికిన్సన్, ఫ్రాంక్లిన్ లేక్స్, NJ, USA) ఉపయోగించి విశ్లేషించబడ్డాయి మరియు క్రమబద్ధీకరించబడ్డాయి. ఫార్వర్డ్ స్కాటర్ మరియు సైడ్ స్కాటర్ ప్రొఫైల్స్ ఆధారంగా ఆచరణీయ కణాలు ఎంపిక చేయబడ్డాయి మరియు ఫార్వర్డ్ స్కాటర్ ఏరియా వర్సెస్ వెడల్పు మరియు సైడ్ స్కాటర్ ఏరియా వర్సెస్ వెడల్పు ఉపయోగించి డబుల్స్ వివక్షకు గురయ్యాయి. HSC జనాభాను CD34 + CD38 - గా నిర్వచించారు. CD34 + CD38 + భిన్నం లోపల, సాధారణ మైలోయిడ్ ప్రొజెనిటర్ కణాలు (CD123 + CD45RA - ), గ్రాన్యులోసైట్-మాక్రోఫేజ్ ప్రొజెనిటర్ కణాలు (CD123 + CD45RA + ) మరియు మెగాకార్యోసైట్-ఎరిథ్రాయిడ్ ప్రొజెనిటర్ కణాలు (CD123 - CD45RA - ) ఎంపిక చేయబడ్డాయి. ఈ కణ భిన్నాల నుండి DNA వేరుచేయడం, తరువాత DNA విస్తరణ, తయారీదారుల ప్రోటోకాల్ ప్రకారం Qiagen REPLI-g సింగిల్ సెల్ కిట్ (Qiagen) ను ఉపయోగించి జరిగింది.

హోల్-ఎక్సోమ్ సీక్వెన్సింగ్

క్రమమైన వ్యవధిలో (రోగికి 2 నుండి 8 నమూనాలు) తీసుకున్న సీక్వెన్షియల్ BM-MNC ( n = 43) మరియు PB-MNC నమూనాలు ( n = 2) పై సగటు 110 of లోతుకు WES ప్రదర్శించారు. రోగులందరికీ, కల్చర్డ్ టి కణాల నుండి వేరుచేయబడిన డిఎన్‌ఎను జెర్మ్‌లైన్ వైవిధ్యాలను మినహాయించడానికి ఒక నిర్మాణాత్మక సూచనగా ఉపయోగించారు. టి కణాల కంటే కణితి కణాలలో గణనీయంగా ఎక్కువ ఉత్పరివర్తనలు అధిక విశ్వాస ఉత్పరివర్తనలుగా జాబితా చేయబడ్డాయి మరియు మా విశ్లేషణలో తీసుకోబడ్డాయి. రెండింటిలో, UPN02 మరియు UPN03 ఒక మ్యుటేషన్ T కణాలను స్పష్టంగా ప్రభావితం చేస్తుంది (వరుసగా VAF 19% మరియు 24%, అనుబంధ డేటా 1 చూడండి), కానీ రెండు సందర్భాల్లోనూ కణితి నమూనాలో VAF గణనీయంగా ఎక్కువగా ఉంది. ఇంకా, ఐదుగురు రోగులకు DNA కల్చర్డ్ MSC ల నుండి అందుబాటులో ఉంది మరియు మల్టీపోటెంట్ HSC లలో పొందిన వైవిధ్యాలు (మరియు టి కణాలు 36 ను కూడా ప్రభావితం చేస్తాయి) నిర్ధారించడానికి అదనపు జెర్మ్‌లైన్ నియంత్రణగా ఉపయోగించబడ్డాయి, అవి జెర్మ్‌లైన్ వేరియంట్‌లుగా తప్పుగా గుర్తించబడ్డాయి మరియు మినహాయించబడ్డాయి. ఈ ఐదుగురు రోగుల టి కణాలలో (అనుబంధ పట్టిక 4) MDS- అనుబంధ ఉత్పరివర్తనలు కనుగొనబడలేదు, ఇది T కణాలు ప్రాణాంతక క్లోన్‌లో భాగం కాదని సూచిస్తుంది.

సురేసెలెక్ట్ హ్యూమన్ ఆల్ ఎక్సాన్ వి 5 (ఎజిలెంట్ టెక్నాలజీస్, శాంటా క్లారా, సిఎ, యుఎస్ఎ) ఉపయోగించి ఎక్సోమ్ క్యాప్చర్ జరిగింది. సుసంపన్నమైన ఎక్సోమ్ శకలాలు అప్పుడు హైసెక్ 2500 ప్లాట్‌ఫాం (ఇల్యూమినా, శాన్ డియాగో, సిఎ, యుఎస్‌ఎ) ఉపయోగించి భారీగా సమాంతర శ్రేణికి లోబడి ఉన్నాయి. సీక్వెన్స్ అలైన్‌మెంట్ మరియు మ్యుటేషన్ కాలింగ్ మా అంతర్గత పైప్‌లైన్‌లను ఉపయోగించి, గతంలో 37 వివరించినట్లుగా, చిన్న మార్పులతో జరిగాయి. (1) ఫిషర్ యొక్క ఖచ్చితమైన P ≤0.001 మరియు (2) కణితి నమూనాలలో VAF with0.07 (తప్పుడు పాజిటివ్ మ్యుటేషన్ కాల్స్ తగ్గించడానికి) తో అభ్యర్థి ఉత్పరివర్తనలు ఎంపిక చేయబడ్డాయి. (1) పర్యాయపద SNV లు, (2) జన్యువులలోని SNV లు, వాటి నిర్మాణం సరిగ్గా ఉల్లేఖించబడలేదు (పూర్తి ఓపెన్ రీడింగ్ ఫ్రేమ్ సమాచారం అందుబాటులో లేదు) మరియు (3) 1000 జీనోమ్స్ ప్రాజెక్ట్ డేటాబేస్లో SNP లుగా జాబితా చేయబడిన SNV లను మినహాయించడం ద్వారా ఈ వైవిధ్యాలు మరింత ఫిల్టర్ చేయబడ్డాయి. నవంబర్ 2010 విడుదల), dbSNP131 లేదా మా అంతర్గత SNP డేటాబేస్. అధిక-సాంద్రత కలిగిన SNP శ్రేణులను BM కణాల నుండి సేకరించిన DNA పై అనేక సమయ బిందువులలో ప్రదర్శించారు, ఇది స్థానిక కాపీ సంఖ్య వ్యత్యాసాల కోసం VAF లను సరిచేయడానికి అనుమతిస్తుంది.

జన్యు ప్యానెల్లను ఉపయోగించి లోతైన సీక్వెన్సింగ్‌ను లక్ష్యంగా చేసుకున్నారు

ఒక రోగి కోసం మేము తెలిసిన 72 ఎండిఎస్ డ్రైవర్ జన్యువులకు (సప్లిమెంటరీ టేబుల్ 2) సురేసెలెక్ట్ (ఎజిలెంట్) ఆధారిత టార్గెట్-క్యాప్చర్ సీక్వెన్సింగ్ ఉపయోగించి అలోజెనిక్ స్టెమ్ సెల్ మార్పిడి తర్వాత సేకరించిన 2 నమూనాలను విశ్లేషించాము. మ్యుటేషన్ కాలింగ్ గతంలో వివరించిన విధంగా 3, చిన్న మార్పులతో జరిగింది. జత చేసిన జెర్మ్‌లైన్ నియంత్రణ నమూనాల WES డేటాను ఉపయోగించి జెర్మ్‌లైన్ SNV లు తొలగించబడ్డాయి. చివరగా, మేము ఖచ్చితంగా ఆంకోజెనిక్ 2 గా పరిగణించబడే ఉత్పరివర్తనాలను మాత్రమే ఎంచుకున్నాము. అదనంగా, సంబంధం లేని క్లోన్లలో డ్రైవర్ ఉత్పరివర్తనాల కోసం స్క్రీన్ చేయడానికి మేము మైలోయిడ్ జన్యు ప్యానెల్ (ట్రూసైట్, ఇల్యూమినా) (సప్లిమెంటరీ టేబుల్ 1) ను ఉపయోగించాము.

టార్గెటెడ్ యాంప్లికాన్-బేస్డ్ డీప్ సీక్వెన్సింగ్

WES చేత కనుగొనబడిన అభ్యర్థి సోమాటిక్ వైవిధ్యాలు అయాన్ టొరెంట్ పర్సనల్ జీనోమ్ మెషిన్ (థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్) పై అధిక లోతులో (లక్ష్యం 10, 000 × కవరేజ్) యాంప్లికాన్-ఆధారిత డీప్ సీక్వెన్సింగ్ ద్వారా ధృవీకరించబడ్డాయి మరియు లెక్కించబడ్డాయి. ఈ విధానాన్ని ఉపయోగించి, ప్రతి రోగికి అందుబాటులో ఉన్న అన్ని పిబి మరియు బిఎమ్ నమూనాలలో పరస్పర భారాన్ని కొలుస్తారు (అనుబంధ డేటా 3). తయారీదారుల ప్రోటోకాల్ ప్రకారం Q 200 బేస్ జతలతో కూడిన శకలాలు వరుసగా రెండు పిసిఆర్ ప్రతిచర్యలలో విస్తరించబడ్డాయి, పిసిఆర్ 1 మరియు పిసిఆర్ 2, రెండూ క్యూ 5 హాట్ స్టార్ట్ హై-ఫిడిలిటీ మాస్టర్ మిక్స్ (న్యూ ఇంగ్లాండ్ బయోలాబ్స్, ఇప్స్విచ్, ఎంఎ, యుఎస్ఎ) ఉపయోగించి ప్రదర్శించబడ్డాయి. . పిసిఆర్ 1 లో, లక్ష్య శకలాలు విస్తరించబడ్డాయి మరియు సాధారణ శ్రేణి (సిఎస్) ట్యాగ్‌లతో ట్యాగ్ చేయబడ్డాయి (ఫ్లూయిడిగ్మ్, సౌత్ శాన్ ఫ్రాన్సిస్కో, సిఎ, యుఎస్‌ఎ రూపొందించారు). ఈ ప్రయోజనం కోసం, ∼ 200 బేస్ జతల యొక్క PCR శకలాలు పొందటానికి సీక్వెన్స్-స్పెసిఫిక్ ప్రైమర్‌లు రూపొందించబడ్డాయి. ఈ ప్రైమర్‌లకు సిఎస్-ట్యాగ్‌లు జతచేయబడ్డాయి (ప్రైమర్ స్ట్రాటజీ మరియు సప్లిమెంటరీ టేబుల్స్ 5 మరియు 6 కోసం సప్లిమెంటరీ ఫిగ్ 17 మరియు ప్రైమర్ సీక్వెన్స్‌ల కోసం సప్లిమెంటరీ డేటా 4 చూడండి). ప్రైమర్ జతపై ఆధారపడి, మూడు ఆప్టిమైజ్ చేసిన టచ్‌డౌన్ పిసిఆర్ ప్రోటోకాల్‌లలో ఉత్తమమైనవి ఉపయోగించబడ్డాయి (అనుబంధ పట్టిక 7 చూడండి). పిసిఆర్ 2 లో, సిఎస్-ట్యాగ్, బార్‌కోడ్ మరియు అడాప్టర్ కలిగిన ప్రైమర్‌లు (ప్రైమర్ స్ట్రాటజీ మరియు సప్లిమెంటరీ టేబుల్స్ 5 మరియు 6 కోసం సప్లిమెంటరీ ఫిగ్ 17 మరియు ప్రైమర్ సీక్వెన్స్‌ల కోసం సప్లిమెంటరీ డేటా 4 చూడండి), పిసిఆర్ శకలాలు నమూనాతో లేబుల్ చేయడానికి ఉపయోగించబడ్డాయి. -స్పెక్సిఫిక్ అయాన్ ఎక్స్‌ప్రెస్ బార్‌కోడ్ (థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్ రూపొందించినది) మరియు ఎమల్షన్ పిసిఆర్‌కు అవసరమైన ఎడాప్టర్లను జోడించండి. రెండవ పిసిఆర్ రెండుసార్లు ప్రదర్శించబడింది, ఒకసారి ఫార్వర్డ్ ప్రైమర్‌కు జతచేయబడిన ఎ అడాప్టర్ మరియు రివర్స్ ప్రైమర్ (పిసిఆర్ 2-ఎ) కు కత్తిరించబడిన పి 1 (టిఆర్‌పి 1) అడాప్టర్ మరియు వైస్ వెర్సా (పిసిఆర్ 2-బి), ద్వి దిశాత్మక శ్రేణిని సాధ్యం చేస్తుంది. పిసిఆర్ 2 కొరకు పిసిఆర్ ప్రోటోకాల్ కొరకు సప్లిమెంటరీ టేబుల్ 8 చూడండి. తదనంతరం, ప్రైమర్ డైమర్‌లను తొలగించడానికి పిసిఆర్ ఉత్పత్తులను అజెన్‌కోర్ట్ ఎమ్‌పూర్ ఎక్స్‌పి పూసలతో (బెక్మాన్-కౌల్టర్, ఫుల్లెర్టన్, సిఎ, యుఎస్‌ఎ) పూల్ చేసి శుద్ధి చేశారు. శుద్దీకరణ తరువాత, పూల్ యొక్క స్వచ్ఛతను (frag హించిన శకలం పరిమాణం ఆధారంగా) హై-సెన్సిటివిటీ D1000 స్క్రీన్‌టేప్ అస్సే (ఎజిలెంట్) ఉపయోగించి ఎజిలెంట్ 2200 టేప్‌స్టేషన్ (ఎజిలెంట్ టెక్నాలజీస్) పై కొలుస్తారు. శుద్ధి చేయబడిన కొలను 3 pg μl −1 కు కరిగించబడుతుంది మరియు అయాన్ PGM మూస OT2 200 కిట్ (థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్) ను ఉపయోగించి ఎమల్షన్ PCR కోసం అయాన్ వన్‌టచ్ సిస్టమ్ (థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్) లో లోడ్ చేయబడింది, తరువాత లోడ్ చేయబడిన అయాన్ స్పియర్ పార్టికల్స్ ( ISP లు). క్యూబిట్ ఫ్లోరోమీటర్ (థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్) పై అయాన్ స్పియర్ క్వాలిటీ కంట్రోల్ కిట్ (థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్) తో సుసంపన్నమైన ISP ల నాణ్యతను తనిఖీ చేశారు. తదనంతరం, ISP లను అయాన్ 314, 316 లేదా 318 v2 చిప్ (థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్) పైకి ఎక్కించి, అయాన్ టోరెంట్ పర్సనల్ జీనోమ్ మెషిన్ సిస్టమ్ (థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్) పై అయాన్ పిజిఎం సీక్వెన్సింగ్ కిట్ వి 2 (థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్) ను ఉపయోగించి క్రమం చేశారు. తయారీదారు ప్రోటోకాల్స్ ప్రకారం అన్ని దశలు జరిగాయి. సీక్వెన్సింగ్ డేటాను GRCh37 (hg19) రిఫరెన్స్ జీనోమ్ బిల్డ్‌కు మ్యాప్ చేశారు మరియు సీక్వెన్స్ పైలట్ సాఫ్ట్‌వేర్, వెర్షన్ 4.2.2 (JSI మెడికల్ సిస్టమ్స్, ఎట్టెన్‌హీమ్, జర్మనీ) యొక్క సీక్ నెక్స్ట్ మాడ్యూల్‌తో వేరియంట్‌లను పిలిచారు. వేరియంట్ల యొక్క స్వయంచాలక కాలింగ్‌తో పాటు, WES చేత వైవిధ్యాలు కనుగొనబడిన అన్ని ప్రదేశాలు మానవీయంగా తనిఖీ చేయబడ్డాయి. కణితి నమూనాలో (ఇది WES కోసం కూడా ఉపయోగించబడింది) జెర్మ్‌లైన్ నమూనాలో (కనీసం 5% వ్యత్యాసం) కంటే ఎక్కువ VAF తో కనుగొనబడినప్పుడు లక్ష్యంగా ఉన్న లోతైన సీక్వెన్సింగ్ ద్వారా ఒక మ్యుటేషన్ ధృవీకరించబడింది. రోగికి సగటు ధ్రువీకరణ రేటు 66.7%. ధృవీకరించబడని చాలా ఉత్పరివర్తనలు WES చేత విస్తరించబడిన DNA నమూనాలో కనుగొనబడిన ఉత్పరివర్తనలు (ప్రధానంగా సి లేదా జి యొక్క చొప్పించడం లేదా తొలగింపులు), లేదా చాలా సమానమైన కుటుంబ సభ్యులను కలిగి ఉన్న జన్యువులలో ఉత్పరివర్తనలు (WES రీడ్‌ల యొక్క తప్పు మ్యాపింగ్). శబ్దం క్రమం నుండి నిజమైన ఉత్పరివర్తనాలను వివరించడానికి సరైన కటాఫ్ VAF ని నిర్ణయించడానికి, అయాన్ టోరెంట్ యొక్క లోతైన సీక్వెన్సింగ్ యొక్క సున్నితత్వం మరియు విశిష్టతను మేము నిర్ణయించాము. 10 ఆరోగ్యకరమైన దాతలలో 8 వేర్వేరు ఉత్పరివర్తనలు ఉన్నాయని మేము విశ్లేషించినప్పుడు, 0.2% VAF కటాఫ్ ఫలితంగా 100% (సప్లిమెంటరీ టేబుల్ 9) యొక్క విశిష్టత ఏర్పడింది. అదనంగా, మేము 3 వేర్వేరు SNP ల యొక్క పలుచన శ్రేణిని తయారు చేసాము మరియు 0.1% యొక్క VAF ఇప్పటికీ ఖచ్చితంగా కనుగొనబడుతుందని గమనించాము (అనుబంధ పట్టిక 10). దీని ఆధారంగా, మేము 0.2% కటాఫ్‌ను ఉపయోగించాము, అంటే 20 / 10, 000 రీడ్‌లు మ్యుటేషన్‌ను కలిగి ఉండాలి. అదనంగా, పరివర్తన చెందిన బేస్ దర్యాప్తు స్థానంలో రెండవ అత్యధిక స్థావరంగా ఉండాలి. ఇది మరింత కష్టమైన సీక్వెన్స్ సందర్భంలో కూడా మ్యుటేషన్ సీక్వెన్సింగ్ శబ్దాన్ని మించిందని నిర్ధారిస్తుంది. అదనంగా, శకలం పొడవు విశ్లేషణను ఉపయోగించి FLT3 -ITD మ్యుటేషన్ కనుగొనబడింది.

మైక్రోఅరే-బేస్డ్ జెనోమిక్ ప్రొఫైలింగ్ (SNP అర్రే)

సైటోస్కాన్ హెచ్‌డి అర్రే ప్లాట్‌ఫాం (అఫిమెట్రిక్స్, ఇంక్., శాంటా క్లారా, సిఎ, యుఎస్‌ఎ) ఉపయోగించి మైక్రోఅరే ఆధారిత జెనోమిక్ ప్రొఫైలింగ్ జరిగింది. తయారీదారుల ప్రోటోకాల్‌ల ప్రకారం హైబ్రిడైజేషన్‌లు జరిగాయి. క్రోమోజోమ్ అనాలిసిస్ సూట్ సాఫ్ట్‌వేర్ ప్యాకేజీ (అఫిమెట్రిక్స్) ను ఉపయోగించి డేటాను విశ్లేషించారు, రిఫరెన్స్ జీనోమ్ బిల్డ్ GRCh37 (hg19) యొక్క ఉల్లేఖనాలను ఉపయోగించి. మైక్రోఅరే-ఆధారిత జెనోమిక్ ప్రొఫైలింగ్ డేటా యొక్క సమగ్ర విశ్లేషణ కోసం, మేము గతంలో అభివృద్ధి చేసిన ఫిల్టరింగ్ పైప్‌లైన్‌ను ఉపయోగించాము. సైమన్స్ మరియు ఇతరుల నుండి స్వీకరించబడిన ప్రమాణాలను ఉపయోగించి వ్యాఖ్యానం జరిగింది. 38 మరియు షౌమన్స్ మరియు ఇతరులు . [39] మొదట, జన్యు కంటెంట్‌తో సంబంధం లేకుండా 5 Mb (సాంప్రదాయిక కార్యోటైపింగ్ యొక్క రిజల్యూషన్) కంటే పెద్ద విభాగాలను ప్రభావితం చేసే అన్ని ఉల్లంఘనలను నిజమైన ఉల్లంఘనలుగా సూచిస్తారు. అదనంగా, తెలిసిన క్యాన్సర్ జన్యువులతో (//cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/census/, నవంబర్ 2012 ప్రవేశించిన తేదీ) సమానమైన 5 Mb కన్నా తక్కువ విభాగాలను ప్రభావితం చేసే అన్ని ఉల్లంఘనలు చేర్చబడ్డాయి. జత చేసిన నియంత్రణ DNA ఉపయోగించబడనందున, స్థాపించబడిన సాధారణ జన్యు వైవిధ్యాలతో సమానమైన మార్పులు మినహాయించబడ్డాయి. ఈ విధానం కోసం, మేము బహిరంగంగా లభించే 'డేటాబేస్ ఆఫ్ జెనోమిక్ వేరియంట్స్' (//projects.tcag.ca/variation) ను ఉపయోగించాము మరియు అదనంగా, అధ్యయనం చేసిన health 1, 000 ఆరోగ్యకరమైన వ్యక్తులలో కనుగొనబడిన కాపీ సంఖ్య మార్పుల (CNA) యొక్క అంతర్గత డేటాబేస్. సైటోస్కాన్ HD ప్లాట్‌ఫాం. హెన్రిచ్స్ మరియు ఇతరులు నివేదించినట్లుగా, అవి 10 Mb పరిమాణంలో ఉంటే మరియు అవి పాల్గొన్న క్రోమోజోమ్‌ల యొక్క టెలోమీర్‌ల వైపుకు విస్తరించినట్లయితే మాత్రమే హిటెరోజైగోసిటీ యొక్క కాపీ-తటస్థ నష్టం యొక్క ప్రాంతాలు పరిగణించబడతాయి. [40] చివరగా, ఇమ్యునోగ్లోబులిన్ మరియు టి-సెల్ రిసెప్టర్ జన్యువులలోని ఫోకల్ సిఎన్‌ఎలను ఈ అధ్యయనం నుండి మినహాయించారు, ఎందుకంటే ఈ సిఎన్‌ఎలు సాధారణంగా పునర్వ్యవస్థీకరించబడిన టి-సెల్ రిసెప్టర్ మరియు సాధారణ రిఫరెన్స్ శాంపిల్స్ యొక్క పిబి లింఫోసైట్స్‌లో ఉన్న ఇమ్యునోగ్లోబులిన్ జన్యువులను సూచిస్తాయి. కణాల యొక్క చిన్న నిష్పత్తిలో ఉన్న మార్పులను నిర్వచించడానికి మరియు తక్కువ ప్రోబ్ సాంద్రత ఉన్న ప్రాంతాలలో నివేదించబడిన మార్పులను తొలగించడానికి అన్ని డేటాను దృశ్యపరంగా తనిఖీ చేశారు. పై ప్రమాణాలను నెరవేర్చిన ఉల్లంఘనలు మాత్రమే జన్యు ప్రొఫైల్‌లలో చేర్చబడ్డాయి మరియు ప్రామాణిక ISCN 2013 నామకరణ వ్యవస్థ 34 ప్రకారం వివరించబడ్డాయి.

క్లోనల్ కూర్పు మరియు పరిణామ నమూనాలను పునర్నిర్మించడం

క్లోనల్ కూర్పు మరియు పరిణామాన్ని విశ్లేషించడానికి వివిధ సాఫ్ట్‌వేర్ సాధనాలు పరీక్షించబడ్డాయి. ఏదేమైనా, వేర్వేరు ప్రోగ్రామ్‌లు వేర్వేరు ఫలితాలను ఇచ్చాయి మరియు క్లోజ్ మాన్యువల్ తనిఖీ అన్ని పరీక్షించిన ప్రోగ్రామ్‌ల ద్వారా ఉత్పత్తి చేయబడిన నమూనాలలో లోపాలను చూపించింది. అందువల్ల, మేము అన్ని సమయాలలో గుర్తించిన అన్ని ఉత్పరివర్తనాల VAF ల ఆధారంగా క్లోనల్ పరిణామ నమూనాలను నిర్మించాము మరియు కార్యోటైపింగ్, ఫిష్ మరియు SNP శ్రేణుల నుండి సమాచారాన్ని చేర్చాము. క్లోనల్ పునర్నిర్మాణం కోసం, A0.2% యొక్క VAF తో కనుగొనబడిన అన్ని వైవిధ్యాలు పరిగణించబడ్డాయి. అన్ని వేర్వేరు సమయ బిందువుల వద్ద అన్ని వరుస నమూనాల (పిబి మరియు బిఎమ్) నుండి VAF ల ఆధారంగా (ప్లాయిడ్ కోసం సరిదిద్దబడింది) ఉత్పరివర్తనలు క్లస్టర్ చేయబడ్డాయి. పరస్పర సంఘటనల యొక్క క్రమం మరియు అత్యంత సంభావ్య క్లోనల్ పరిణామ నమూనా ఈ మ్యుటేషన్ సమూహాల నుండి మరియు సమయం లో వారి ప్రవర్తన నుండి తీసుకోబడ్డాయి.

In UPN05, the clonal evolution pattern was calculated for the mononuclear myeloid cell fraction, rather than for the total BM-MNC fraction, as this patient developed bone marrow fibrosis and PB lymphocytosis, resulting in noncomparable sampling before and during treatment with romiplostim. In all other patients, lymphocyte counts were stable over time.

డేటా లభ్యత

Sequencing data (fastq files) of all 11 patients have been deposited into the NCBI Sequence Read Archive under accession number SRP094064. All other remaining data are available within the Article and Supplementary Files, or available from the authors on request.

అనుబంధ సమాచారం

PDF ఫైళ్లు

  1. 1.

    అనుబంధ సమాచారం

    Supplementary Figures and Supplementary Tables

  2. 2.

    పీర్ రివ్యూ ఫైల్

ఎక్సెల్ ఫైల్స్

  1. 1.

    అనుబంధ డేటా 1

    Table containing all the validated mutations in the eleven investigated MDS patients

  2. 2.

    అనుబంధ డేటా 2

    Table containing the results from cytogenetic analysis (karyotyping and FISH) of the eleven investigated MDS patients

  3. 3.

    అనుబంధ డేటా 3

    Table containing the variant and reference read counts for all mutations at all different time points of the eleven investigated MDS patients

  4. 4.

    అనుబంధ డేటా 4

    Target specific primer sequences for all PCR reactions

వ్యాఖ్యలు

వ్యాఖ్యను సమర్పించడం ద్వారా మీరు మా నిబంధనలు మరియు సంఘ మార్గదర్శకాలకు కట్టుబడి ఉండాలని అంగీకరిస్తున్నారు. మీరు దుర్వినియోగమైనదాన్ని కనుగొంటే లేదా అది మా నిబంధనలు లేదా మార్గదర్శకాలకు అనుగుణంగా లేనట్లయితే దయచేసి దాన్ని అనుచితమైనదిగా ఫ్లాగ్ చేయండి.