Cd300c ప్రత్యేకంగా cd56 బ్రైట్ నేచురల్ కిల్లర్ కణాలపై వ్యక్తీకరించబడుతుంది మరియు లిగాండ్ గుర్తింపుపై cd300a నుండి భిన్నంగా ఉంటుంది | శాస్త్రీయ నివేదికలు

Cd300c ప్రత్యేకంగా cd56 బ్రైట్ నేచురల్ కిల్లర్ కణాలపై వ్యక్తీకరించబడుతుంది మరియు లిగాండ్ గుర్తింపుపై cd300a నుండి భిన్నంగా ఉంటుంది | శాస్త్రీయ నివేదికలు

Anonim

విషయము

  • సహజమైన రోగనిరోధక శక్తి
  • NK కణాలు

నైరూప్య

NK కణాలపై జత చేసిన గ్రాహకాలు బంధన సామర్ధ్యం యొక్క వైవిధ్యమైన బలాన్ని కలిగి ఉన్న సారూప్య లిగాండ్లను గుర్తించి వేర్వేరు విధులను నిర్వహిస్తాయి. CD300 అణువులు వాటి లిపిడ్-ప్రకృతి లిగాండ్‌లతో పరస్పర చర్య చేయడం వల్ల ఆరోగ్యం మరియు వ్యాధిలో నవల రోగనిరోధక నియంత్రకాలుగా అభివృద్ధి చెందుతున్నాయి. ముఖ్యంగా, జత చేసిన గ్రాహకాలు CD300c మరియు CD300a వరుసగా సక్రియం మరియు నిరోధక సామర్థ్యాలను పొందుతాయి. ప్రస్తుత అధ్యయనంలో, మానవ NK కణాలపై CD300c యొక్క వ్యక్తీకరణ మరియు పనితీరును పరిశోధించడానికి మేము ప్రయత్నిస్తాము. IL-2 మరియు IL-15 చికిత్స CD56 ప్రకాశవంతమైన NK కణాలపై ప్రత్యేకంగా CD300c వ్యక్తీకరణను గణనీయంగా ప్రేరేపిస్తుందని మేము నిరూపించాము. CD300c అప్-రెగ్యులేషన్‌కు STAT5 అవసరం మరియు దాని వ్యక్తీకరణ IL-4 చే నిరోధించబడుతుంది. సక్రియం చేయబడిన CD4 + T కణాల నుండి స్రవించే IL-2 ప్రత్యేకంగా CD56 ప్రకాశవంతమైన NK కణాలపై CD300c యొక్క వ్యక్తీకరణను ప్రేరేపిస్తుంది. ఒక నిర్దిష్ట యాంటీబాడీతో సిడి 300 సి క్రాస్‌లింక్ చేయడం వల్ల కెమోకిన్ మరియు సైటోకిన్ స్రావాన్ని క్షీణించి, ప్రేరేపించడానికి సిడి 56 ప్రకాశవంతమైన ఎన్‌కె కణాల నైపుణ్యాన్ని పెంచుతుంది. CD300a మరియు CD300c ల యొక్క అవకలన బంధాన్ని వారి లిగాండ్స్ ఫాస్ఫాటిడైలేథనోలమైన్ (PE) మరియు ఫాస్ఫాటిడైల్సెరిన్ (PS) లకు మరియు CD56 ప్రకాశవంతమైన NK సెల్ ఫంక్షన్లను ప్రభావితం చేసే వారి అవకలన సామర్థ్యాన్ని కూడా మేము చూపిస్తాము. మా ఫలితాలు జత చేసిన గ్రాహకాల సిడి 300 ఎ మరియు సిడి 300 సి యొక్క నవల సమితిపై అంతర్దృష్టిని అందిస్తాయి, ఇవి సిడి 56 ప్రకాశవంతమైన ఎన్‌కె కణాలపై విభిన్న ప్రభావశీల ఫంక్షన్లతో విలక్షణంగా వ్యక్తీకరించబడతాయి.

పరిచయం

నేచురల్ కిల్లర్ (ఎన్‌కె) కణాలు సహజమైన రోగనిరోధక వ్యవస్థలో కీలక పాత్రకు ప్రసిద్ది చెందాయి; కణితి-రూపాంతరం చెందిన మరియు వైరస్-సోకిన కణాలకు వ్యతిరేకంగా సహజ సైటోటాక్సిసిటీని ప్రదర్శిస్తుంది, అలాగే రోగనిరోధక-నియంత్రణ సైటోకిన్లు 1, 2, 3 ను స్రవిస్తుంది. వాటి పనితీరు సక్రియం మరియు నిరోధక గ్రాహకాలు 4, 5 రెండింటి ద్వారా నియంత్రించబడుతుంది. రెండు రకాల గ్రాహకాల కోసం లిగాండ్‌లతో విభిన్న సెల్యులార్ లక్ష్యాల యొక్క సంక్లిష్ట పరస్పర చర్యలు NK సెల్ నిరోధం (సహనం) లేదా క్రియాశీలతను నిర్ణయిస్తాయి (స్వీయ మరియు ఒత్తిడి-ప్రేరిత స్వీయ తప్పిపోయినవి). అదనంగా, మోనోసైట్లు, మాక్రోఫేజెస్ మరియు డెన్డ్రిటిక్ కణాలు (DC) నుండి స్రవించే IL-12, IL-15, IL-18 మరియు IL-1β వంటి సైటోకిన్లు NK కణాలను 6, 7, 8, 9 సక్రియం చేసే ప్రాథమిక సంకేతాలు. ఇటీవలి సంవత్సరాలలో, అనుకూల రోగనిరోధక ప్రతిస్పందనల యొక్క NK సెల్-మధ్యవర్తిత్వ నియంత్రణ యొక్క ప్రాముఖ్యత NK-DC క్రాస్ టాక్, యాంటిజెన్ ప్రెజెంటింగ్ కణాలతో సంకర్షణ మరియు టిని మాడ్యులేట్ చేయడంలో వారు కలిగి ఉన్న ప్రభావం వంటి వివిధ దృశ్యాలలో కూడా అన్వేషించబడింది. మరియు B సెల్ స్పందనలు 7, 10, 11, 12, 13, 14 . అంతేకాకుండా, అడాప్టివ్ రోగనిరోధక వ్యవస్థ (యాంటిజెన్-స్పెసిఫిక్ టి సెల్స్) నుండి IL-2 వంటి స్టిమ్యులేటరీ సిగ్నల్స్ ద్వితీయ లింఫోయిడ్ అవయవాలలో CD56 ప్రకాశవంతమైన NK సెల్ ఉపసమితిని సక్రియం చేస్తాయని మరియు దాని ప్రభావ పనితీరును 15, 16 మాడ్యులేట్ చేయగలదని తేలింది.

మానవ NK కణాలు CD56 యొక్క వ్యక్తీకరణ మరియు వాటి కణ ఉపరితలంపై CD3 లేకపోవడం ద్వారా సమలక్షణంగా వర్గీకరించబడతాయి. CD56 వ్యక్తీకరణ యొక్క ఉపరితల సాంద్రతను పరిశీలిస్తే, NK కణాలు రెండు విభిన్న ఉపసమితులుగా విభజించబడ్డాయి, CD56 ప్రకాశవంతమైన మరియు CD56 మసక . అంచున, సుమారు 90% మానవ NK కణాలు CD56 మసకబారిన అధిక స్థాయి CD16 (FcγRIII) ను వ్యక్తీకరిస్తాయి మరియు ఇవి ప్రధానంగా సైటోటాక్సిక్ పనితీరులో ఉంటాయి. దీనికి విరుద్ధంగా, 5-10% ఎన్‌కె కణాలు మాత్రమే సిడి 56 ప్రకాశవంతమైనవి మరియు సిడి 16 డిమ్ / నెగ్, శోథ నిరోధక సైటోకిన్‌లను 17, 18, 19, 20 స్రవిస్తాయి . ఫంక్షన్లలో వారి వైవిధ్యమైన తేడాల మాదిరిగానే, ఈ రెండు ఉపసమితులు వాటి ఉపరితలంపై భిన్నమైన గ్రాహకాలను వ్యక్తీకరిస్తాయి, వీటిలో సక్రియం మరియు నిరోధక గ్రాహకాలు, సంశ్లేషణ అణువులు మరియు కెమోకిన్ గ్రాహకాలు 21, 22, 23 ఉన్నాయి . ఈ వైవిధ్యాలలో కొన్ని ఎన్కె కణాలను వేర్వేరు లింఫోయిడ్ కణజాలాలకు చేరుకోవడాన్ని నిర్ణయిస్తాయి. ఉదాహరణకు, CD56 ప్రకాశవంతమైన NK కణాలు ద్వితీయ లింఫోయిడ్ అవయవాలకు నిలయంగా ఉన్నాయి, ఇక్కడ అవి NK సెల్ జనాభాలో సుమారు 90% ఉన్నాయి. ఇంకా, CD56 ప్రకాశవంతమైన మరియు CD56 మసక కణాలు విస్తరణ కోసం IL-2 కు వారి ప్రతిస్పందనలో భిన్నంగా ఉంటాయి. CD56 ప్రకాశవంతమైన కణాలు వాటి ఉపరితలంపై అధిక మరియు ఇంటర్మీడియట్-అఫినిటీ IL-2 గ్రాహకాల యొక్క అధిక స్థాయిని వ్యక్తీకరిస్తాయి, ఇవి IL-2 24, 25, 26 తక్కువ సాంద్రతలలో కూడా విస్తరించడానికి వీలు కల్పిస్తాయి . IL-2 మాదిరిగానే, IL-15 కూడా హెటెరో-ట్రిమెరిక్ రిసెప్టర్ కాంప్లెక్స్‌లతో అధిక అనుబంధంతో బంధిస్తుంది, వీటిలో IL-2 / 15Rβ (CD122), సాధారణ గొలుసు (γc లేదా CD132) మరియు IL-15Rα 9, 15, 27 . సిగ్నల్ ట్రాన్స్డ్యూసెర్ మరియు యాక్టివేటర్ ఆఫ్ ట్రాన్స్క్రిప్షన్ (STAT) అణువుల వంటి దిగువ సిగ్నలింగ్ అణువులను ఫాస్ఫోరైలేట్ చేయడానికి జానస్ టైరోసిన్-కినేస్ (JAK) -3 ద్వారా సిగ్నల్ను ప్రసారం చేసే ప్రధాన భాగం γc. ఈ సిగ్నలింగ్ ప్రతి గ్రాహక సముదాయానికి ప్రత్యేకమైనది. ఈ సందర్భంలో, IL-2 మరియు IL-15 ప్రధానంగా STAT5 ను సక్రియం చేయడం, క్రియాశీలత, విస్తరణ వంటి సెల్యులార్ ఫంక్షన్లను ప్రేరేపించడానికి మరియు NK కణాల 27, 28 యొక్క గ్రాహక సంగ్రహాలను కూడా నియంత్రిస్తాయి.

హ్యూమన్ సిడి 300 ఫ్యామిలీ ఆఫ్ రిసెప్టర్స్ ఎనిమిది టైప్-ఐ మెమ్బ్రేన్ గ్లైకోప్రొటీన్ల సమూహం, ఇవి ఒకే ఐజివి లాంటి ఎక్స్‌ట్రాసెల్యులార్ డొమైన్‌ను కలిగి ఉంటాయి మరియు రోగనిరోధక ప్రక్రియల యొక్క విభిన్న శ్రేణిని నియంత్రిస్తాయి. ఈ కుటుంబం క్రోమోజోమ్ 17 పై క్లస్టర్ చేయబడింది. ఏడుగురు సభ్యులు (సిడి 300 అహ్) ల్యూకోసైట్లపై 29, 30 వ్యక్తీకరించారు. ఎనిమిదవ సభ్యుడు, CD300g, ఎండోథెలియల్ కణాలు 31 లో మాత్రమే కనుగొనబడుతుంది. హ్యూమన్ యాక్టివేటింగ్ గ్రాహకాలు, CD300b, CD300c, CD300d, CD300e మరియు CD300h వేర్వేరు అడాప్టర్ అణువులైన Fc moleculesRIγ గొలుసు, DNAX- యాక్టివేటింగ్ ప్రోటీన్ (DAP) -12 లేదా DAP10 వంటి వాటితో ట్రాన్స్-మెమ్బ్రేన్ డొమైన్‌లోని చార్జ్డ్ అవశేషాల ద్వారా అనుబంధిస్తాయి. దీనికి విరుద్ధంగా, మానవ నిరోధక గ్రాహకాలు, CD300a మరియు CD300f, సైటోప్లాస్మిక్ తోక 29 లోని వాటి ఇమ్యునో-రిసెప్టర్ టైరోసిన్-ఆధారిత నిరోధక మూలాంశాలు (ITIM లు) ద్వారా నిరోధక సంకేతాలను పొందుతాయి. ఈ గ్రాహక కుటుంబానికి లిగాండ్‌లు ఎక్కువగా లిపిడ్ స్వభావం కలిగి ఉంటాయి, వీటిలో ఫాస్ఫాటిడైల్సెరిన్ (పిఎస్) మరియు ఫాస్ఫాటిడైలేథనోలమైన్ (పిఇ), చనిపోయిన మరియు ఉత్తేజిత కణాల ప్లాస్మా పొర యొక్క బయటి కరపత్రంపై వ్యక్తీకరించబడిన రెండు అమైనో-ఫాస్ఫోలిపిడ్లు 32, 33 . అత్యంత హోమోలాగస్ సభ్యులు CD300a మరియు CD300c ని వరుసగా నిరోధక మరియు సక్రియం చేసే పాత్రలతో జత చేసిన గ్రాహకాలుగా భావిస్తారు. ఈ గ్రాహకాలను ఎన్కోడింగ్ చేసే ట్రాన్స్క్రిప్ట్స్ మైలోయిడ్ మరియు లింఫోయిడ్ వంశాల నుండి కణాలలో నివేదించబడినప్పటికీ, సిడి 300 ఎ మరియు సిడి 300 సి యొక్క గ్రాహక వ్యక్తీకరణ నిర్దిష్ట ప్రతిరోధకాలు లేకపోవడం వల్ల సెల్ ఉపరితలంపై వేరు చేయలేవు. అయితే, ఇటీవల మేము ఒక నిర్దిష్ట యాంటీబాడీ క్లోన్, టిఎక్స్ 45, సిడి 300 సిని గుర్తిస్తుంది కాని సిడి 300 ఎ 35 కాదు .

ఇంతకుముందు, ఎన్‌కె కణాలపై సిడి 300 ఎ పాత్ర ఎన్‌కె కణాలు 36, 37 ద్వారా లక్ష్య కణాల హత్యను నిరోధించడానికి సంకేతాలను వెలికితీసేందుకు పరిశోధించబడింది. అయినప్పటికీ, ఎన్‌కె కణాలపై సిడి 300 సి యొక్క వ్యక్తీకరణ మరియు పనితీరు ఇంకా స్పష్టంగా తెలియలేదు. ఇక్కడ, CD300c యొక్క వ్యక్తీకరణ CD-6 ప్రకాశవంతమైన NK కణాలపై IL-2 లేదా IL-15 తో చికిత్స పొందినప్పుడు ప్రత్యేకంగా ప్రేరేపించబడిందని మేము చూపిస్తాము. అదనంగా, దాని వ్యక్తీకరణ IL-4 సమక్షంలో నిరోధించబడిందని మరియు ట్రాన్స్క్రిప్షన్ కారకం STAT5 చే నియంత్రించబడుతుందని మేము ప్రదర్శిస్తాము. ఒక నిర్దిష్ట మోనోక్లోనల్ యాంటీబాడీతో CD300c యొక్క క్రాస్-లింక్ చేయడం CD56 ప్రకాశవంతమైన NK కణాల యొక్క ప్రభావవంతమైన పనితీరులను (డీగ్రాన్యులేషన్ మరియు సైటోకిన్ స్రావం) పెంచుతుందని మేము చూపించాము. చివరగా, మేము వారి లిగాండ్స్ PE మరియు PS లకు CD300a మరియు CD300c యొక్క అవకలన బంధాన్ని ప్రదర్శిస్తాము మరియు ఈ లిగాండ్‌లతో సంభాషించిన తర్వాత CD56 ప్రకాశవంతమైన NK కణాల యొక్క స్పష్టమైన ప్రతిస్పందనను వెల్లడిస్తాము. మా ఫలితాలు CD56 ప్రకాశవంతమైన NK కణాలపై వ్యక్తీకరించబడిన జత చేసిన గ్రాహకాల - CD300a మరియు CD300c - యొక్క నవల సమితిపై అంతర్దృష్టిని అందిస్తాయి.

ఫలితాలు

CD300c ప్రత్యేకంగా CD56 ప్రకాశవంతమైన NK కణాలపై వ్యక్తీకరించబడింది

నిర్దిష్ట మోనోక్లోనల్ యాంటీబాడీ క్లోన్ TX45 35 ను ఉపయోగించి మానవ మోనోసైట్లపై CD300c వ్యక్తీకరించబడిందని ఇటీవల మేము నిరూపించాము. NK కణాలపై CD300c యొక్క వ్యక్తీకరణను అంచనా వేయడానికి, మేము అదే యాంటీబాడీని ఉపయోగించాము మరియు సైటోకిన్ స్టిమ్యులేషన్ CD300c యొక్క వ్యక్తీకరణను ప్రభావితం చేస్తుందా అని పరిశోధించాము. మేము ఎన్‌కె కణాలను సక్రియం చేసే అనేక రకాల సైటోకిన్‌లతో ఉత్తేజపరిచాము మరియు సిడి 300 సి ఎక్స్‌ప్రెషన్‌ను సిడి 56 ప్రకాశవంతమైన (సిడి 56 హై సిడి 16 నెగ్ ) ఉపసమితిలో మాత్రమే ఐఎల్ -2 మరియు ఐఎల్ -15 గణనీయంగా నియంత్రిస్తాయని ధృవీకరించాము. దీనికి విరుద్ధంగా, NK కణాల CD56 మసక (CD56 తక్కువ CD16 pos ) ఉపసమితిలో ఎటువంటి వ్యక్తీకరణ కనుగొనబడలేదు. NK కణాలను IL-4, IL-12, IL-18 మరియు IL-21 తో చికిత్స చేసినప్పుడు, CD300c వ్యక్తీకరణ NK సెల్ ఉపసమితుల్లో (Fig. 1A, B) రెండింటిలోనూ మార్చబడలేదని మేము గమనించాము. అంతేకాకుండా, CD56 ప్రకాశవంతమైన NK సెల్ ఉపసమితిలో CD56 అధిక CD16 మసక NK కణాలు కూడా IL-2 మరియు IL-15 చికిత్సపై CD300c ను వ్యక్తం చేశాయి (అనుబంధ మూర్తి). CD300c వ్యక్తీకరణ IL-2 పై ఆధారపడి ఉంటుంది కాబట్టి, లింఫోకిన్-యాక్టివేటెడ్ కిల్లర్ (LAK) కణాల దృగ్విషయాన్ని అనుకరిస్తూ 7 రోజులు IL-2 యొక్క సుదీర్ఘ చికిత్స తర్వాత మేము దాని వ్యక్తీకరణను NK కణాలపై పరీక్షించాము. CD300c వ్యక్తీకరణ CD56 ప్రకాశవంతమైన ఉపసమితులపై మాత్రమే నిర్వహించబడుతుందని మేము చూపించాము కాని CD56 మసక ఉపసమితిలో కాదు (అనుబంధ మూర్తి). CD300c యొక్క వ్యక్తీకరణ లిప్యంతరీకరణగా నియంత్రించబడిందని మరింత ధృవీకరించడానికి, మేము రెండు NK సెల్ ఉపసమితులను క్రమబద్ధీకరించాము మరియు IL-2 మరియు IL-15 తో చికిత్స తర్వాత సంబంధిత mRNA స్థాయిలను విశ్లేషించాము. గతంలో, మేము మరియు ఇతరులు CD300a అన్ని NK సెల్ ఉపసమితుల సెల్ ఉపరితలంపై 35, 36 వ్యక్తీకరించబడిందని నిరూపించాము, కాబట్టి మేము CD300a ని నియంత్రణగా ఎంచుకున్నాము. CD300c ఎన్కోడింగ్ ట్రాన్స్క్రిప్ట్స్ CD56 ప్రకాశవంతమైన NK కణాలలో సైటోకిన్ ఉద్దీపనపై గణనీయంగా నియంత్రించబడిందని మేము ధృవీకరించాము కాని CD56 మసక NK కణాలపై కాదు. దీనికి విరుద్ధంగా, CD300a (Fig. 1C) ఎన్కోడింగ్ ట్రాన్స్క్రిప్ట్ స్థాయిలలో IL-2 మరియు IL-15 ఉద్దీపన ప్రభావం చూపలేదు. జత చేసిన గ్రాహకాల యొక్క వ్యక్తీకరణ CD300a మరియు CD300c CD56 ప్రకాశవంతమైన NK కణాలపై భేదాత్మకంగా నియంత్రించబడుతుందని ఈ ఫలితాలు సూచిస్తున్నాయి.

Image

( ) CD56 ప్రకాశవంతమైన మరియు CD56 మసక జనాభాను (ఎగువ ప్యానెల్) వేరు చేయడానికి NK కణాల గేటింగ్ వ్యూహం చూపబడింది. దిగువ ప్యానెల్‌లోని డాట్ ప్లాట్లు వివిధ సైటోకిన్ ఉద్దీపనలపై 40 గంటలు CD300c + NK కణాల శాతాన్ని సూచిస్తాయి. ( బి ) IL-2 మరియు IL-15 తో ప్రేరేపించబడిన CD56 ప్రకాశవంతమైన ఉపసమితులపై CD300c వ్యక్తీకరణ యొక్క గణనీయమైన నియంత్రణను బార్ గ్రాఫ్ చూపిస్తుంది. డేటా 4–6 దాతల నుండి స్వతంత్ర ప్రయోగాల నుండి. ( సి ) CD300A మరియు CD300C యొక్క నిర్దిష్ట mRNA ట్రాన్స్‌క్రిప్ట్‌లు RT-PCR విశ్లేషణ ద్వారా నిర్ణయించబడ్డాయి, అవి వేర్వేరు ఉపసమితుల క్రమబద్ధీకరించని, IL-2 మరియు IL-15 ఉత్తేజిత NK కణాల క్రమబద్ధీకరించబడిన జనాభాపై. Y- అక్షం 18sRNA పై సాధారణీకరించిన వ్యక్తీకరణను సూచిస్తుంది మరియు సంబంధిత ΔΔCt విలువలు ప్లాట్ చేయబడతాయి. డేటా నాలుగు ఆరోగ్యకరమైన దాతల నుండి. లోపం పట్టీలు సగటు ± SEM ను సూచిస్తాయి.

పూర్తి పరిమాణ చిత్రం

CD300c యొక్క వ్యక్తీకరణ STAT5 మరియు IL-4 చే నియంత్రించబడుతుంది

IL-2 మరియు IL-15 చేత ప్రేరేపించబడిన ప్రధాన యంత్రాంగాలలో ఒకటి STAT5 27 యొక్క క్రియాశీలత. తరువాతి పాత్రను నిర్ణయించడానికి, మేము NK కణాలను ఒక నిరోధకం, N ′ - ((4-ఆక్సో -4 హెచ్-క్రోమెన్ -3-యిల్) మిథైలీన్) నికోటినోహైడ్రాజైడ్తో చికిత్స చేసాము, ఇది IL సమక్షంలో STAT5 యొక్క జీవ పనితీరును అడ్డుకుంటుంది. -2 లేదా IL-15, మరియు CD56 ప్రకాశవంతమైన NK సెల్ ఉపసమితిలో (Fig. 2A, B) CD300c యొక్క వ్యక్తీకరణ గణనీయంగా తగ్గిందని మేము గమనించాము. T కణాలలో, JAK1 మరియు JAK3 38 యొక్క కైనేస్ కార్యకలాపాలను తగ్గించడం-నియంత్రించే ఒక విధానం ద్వారా IL-4 IL-2- ప్రేరేపిత STAT5 క్రియాశీలతను నిరోధించిందని నిరూపించబడింది. అందువల్ల, CD300c యొక్క IL-2 మరియు IL-15 మధ్యవర్తిత్వ వ్యక్తీకరణను నియంత్రించడంలో IL-4 పాత్రను అధ్యయనం చేసాము. IL-2 లేదా IL-15 తో కలిపి సంస్కృతిలో IL-4 ను చేర్చడం వలన IL-2 లేదా IL-15 చికిత్స కణాలతో (Fig. 2C, D) పోల్చినప్పుడు CD56 ప్రకాశవంతమైన NK కణాలపై CD300c వ్యక్తీకరణ గణనీయంగా తగ్గింది. అందువల్ల, CD56 ప్రకాశవంతమైన NK కణాలపై CD300c వ్యక్తీకరణ STAT5 క్రియాశీలతపై ఆధారపడి ఉంటుందని మరియు IL-4 చేత ప్రతికూలంగా నియంత్రించబడుతుందని మా ఫలితాలు సూచిస్తున్నాయి.

Image

( ) STAT5 నిరోధకం సమక్షంలో లేదా లేకపోవడంతో శుద్ధి చేయబడిన NK కణాలు IL-2 లేదా IL-15 తో ప్రేరేపించబడ్డాయి. చికిత్స చేయని (షేడెడ్), IL-2 లేదా IL-15 ప్లస్ వెహికల్ DMSO ప్రాతినిధ్యం వహిస్తున్న (మందపాటి గీత) మరియు IL-2 లేదా IL-15 ప్లస్ STAT5 నిరోధకం (చుక్కల రేఖ) వేర్వేరు NK సెల్ ఉపసమితులపై CD300c యొక్క వ్యక్తీకరణను ప్రతినిధి హిస్టోగ్రామ్‌లు చూపుతాయి. ). ( బి ) సూచించిన చికిత్సలతో CD56 ప్రకాశవంతమైన NK కణాలపై CD300c వ్యక్తీకరణ యొక్క MFI ను బార్ గ్రాఫ్ సూచిస్తుంది. ( సి ) ప్రతినిధి హిస్టోగ్రాములు వేర్వేరు ఎన్‌కె సెల్ ఉపసమితులపై సిడి 300 సి యొక్క వ్యక్తీకరణను చికిత్స చేయని (షేడెడ్), ఐఎల్ -2 లేదా ఐఎల్ -15 ప్రాతినిధ్యం వహిస్తాయి (మందపాటి గీత) మరియు ఐఎల్ -2 లేదా ఐఎల్ -15 తో ఐఎల్ -4 (చుక్కలు) గీత). ( డి ) బార్ గ్రాఫ్ సూచించిన చికిత్సలతో CD56 ప్రకాశవంతమైన NK కణాలపై CD300c వ్యక్తీకరణ యొక్క MFI ని సూచిస్తుంది. డేటా 4 దాతల నుండి స్వతంత్ర ప్రయోగాల నుండి. లోపం పట్టీలు సగటు ± SEM ను సూచిస్తాయి.

పూర్తి పరిమాణ చిత్రం

T సెల్-ఉత్పన్న IL-2 CD56 ప్రకాశవంతమైన NK కణాలపై CD300c యొక్క వ్యక్తీకరణను ప్రేరేపిస్తుంది

అనేక అధ్యయనాలు CD56 ప్రకాశవంతమైన NK కణాలు ద్వితీయ లింఫోయిడ్ అవయవాలలో స్థానీకరిస్తాయి మరియు కొనసాగుతున్న అనుకూల రోగనిరోధక ప్రతిస్పందనలలో ముఖ్యమైన పాత్ర పోషిస్తాయి. ఈ ప్రతిస్పందనల సమయంలో, APC- ఉత్తేజిత T కణాలు IL-2 ను స్రవిస్తాయి మరియు చివరికి CD56 ప్రకాశవంతమైన కణాల యొక్క అధిక అనుబంధ IL-2 గ్రాహకంతో సంకర్షణ చెందుతాయి, ఇది NK మరియు T సెల్ క్రాస్ టాక్ 15 ను పెంచుతుంది. CD5 + ప్రకాశవంతమైన NK కణాలపై CD300c యొక్క వ్యక్తీకరణను మేము ట్రాన్స్‌వెల్ అస్సేలో CD4 + T కణాలతో వాటి ప్రతిరూపంగా పరిశీలించాము. మా ప్రయోగాలలో, మేము అదే దాత నుండి ఆటోలోగస్ అమాయక CD4 + T కణాలు మరియు NK కణాలను శుద్ధి చేసాము. యాంటీ సిడి 3 / సిడి 28 పూసలను ఉపయోగించి విస్తరించిన మరియు సక్రియం చేసిన సిడి 4 + టి కణాలు పొందబడ్డాయి. పున omb సంయోగం IL-2 తో గమనించిన ఫలితాల మాదిరిగానే, NK కణాలు మరింత సక్రియం అవుతాయని సూచించే సక్రియం చేయబడిన CD4 + T కణాల సమక్షంలో సంస్కృతి చేసినప్పుడు NK కణాల పదనిర్మాణం మరింత సమూహంగా ఉంటుంది. NK కణాలు మాధ్యమంతో ఒంటరిగా లేదా CD4 + T కణాలతో విశ్రాంతి తీసుకున్నప్పుడు ఈ దృగ్విషయం గమనించబడదు (Fig. 3A). అప్పుడు, విశ్రాంతి మరియు సక్రియం చేయబడిన CD4 + T కణాలతో సంస్కృతి చేసినప్పుడు CD56 ప్రకాశవంతమైన NK కణాలపై CD300c యొక్క వ్యక్తీకరణను మేము నిర్ణయించాము. Expected హించిన విధంగా, CD300c వ్యక్తీకరణ మెరుగుపరచబడింది మరియు IL-2 యొక్క జీవసంబంధ కార్యకలాపాలను నిరోధించడానికి ఒక నిర్దిష్ట యాంటీబాడీని ఉపయోగించినప్పుడు మాత్రమే ఈ ప్రభావం నిరోధించబడుతుంది. ఐసోటైప్ నియంత్రణ ఎటువంటి ప్రభావాన్ని చూపలేదు. మరోవైపు, మీడియం మాత్రమే మరియు విశ్రాంతి CD4 + T కణాలు CD300c వ్యక్తీకరణలో ఎటువంటి మార్పును ప్రేరేపించలేదు (Fig. 3B, C). అందువల్ల, సక్రియం చేయబడిన CD4 + T కణాల నుండి స్రవించే IL-2 CD56 ప్రకాశవంతమైన NK కణాలపై CD300c వ్యక్తీకరణను ప్రత్యేకంగా నియంత్రిస్తుంది.

Image

( ) ట్రాన్స్-వెల్ అస్సేలో పున omb సంయోగం IL-2 (rIL-2) లేదా యాక్టివేట్ చేసిన CD4 + T కణాల సమక్షంలో కల్చర్ చేసినప్పుడు NK కణాలు సమూహాలను ఏర్పరుస్తాయి. ( బి ) మెటీరియల్స్ మరియు మెథడ్స్‌లో వివరించిన విధంగా ట్రాన్స్‌వెల్ అస్సేలో అనేక పరిస్థితులలో కల్చర్ చేయబడిన CD300c + CD56 ప్రకాశవంతమైన NK కణాల శాతాన్ని హిస్టోగ్రామ్‌లు సూచిస్తాయి. ( సి ) ట్రాన్స్‌వెల్ అస్సేలో సూచించిన పరిస్థితులలో కల్చర్ చేయబడిన CD56 ప్రకాశవంతమైన NK కణాలపై CD300c వ్యక్తీకరణ యొక్క MFI ను బార్ గ్రాఫ్ సూచిస్తుంది. డేటా 4 దాతల నుండి స్వతంత్ర ప్రయోగాల నుండి. లోపం పట్టీలు సగటు ± SEM ను సూచిస్తాయి. rCD4 T- కణాలు: విశ్రాంతి CD4 + T కణాలు; aCD4 T- కణాలు: సక్రియం చేయబడిన CD4 + T కణాలు; α-IL-2: వ్యతిరేక IL-2 mAb ను తటస్తం చేయడం; rec IL-2: పున omb సంయోగం IL-2.

పూర్తి పరిమాణ చిత్రం

CD300c యొక్క క్రాస్‌లింకింగ్ CD56 ప్రకాశవంతమైన NK కణాలను సైటోకైన్‌లను క్షీణించి, స్రవిస్తుంది

CD56 ప్రకాశవంతమైన NK కణాలపై CD300c యొక్క వ్యక్తీకరణ క్రియాత్మక పాత్రను కలిగి ఉందో లేదో తెలుసుకోవడానికి, CD300c నిర్దిష్ట మోనోక్లోనల్ యాంటీబాడీ క్లోన్ TX45 35 తో క్రాస్‌లింక్ చేయబడింది మరియు సైటోకైన్‌లను క్షీణించి ఉత్పత్తి చేసే NK కణాల సామర్థ్యాన్ని అంచనా వేసింది. సిడి 107 ఎ / బి యొక్క వ్యక్తీకరణ మరియు ప్రో-ఇన్ఫ్లమేటరీ సైటోకిన్ టిఎన్ఎఫ్- α మరియు కెమోకిన్ ఎంఐపి -1α (Fig. 4A, B) యొక్క ప్రేరణ ద్వారా కొలవబడినట్లుగా, TX45 తో IL-2 ప్రీ-యాక్టివేటెడ్ NK కణాల క్రాస్‌లింక్ గణనీయంగా NK సెల్ క్షీణతను పెంచింది., IL-2 ప్రీ-యాక్టివేటెడ్ NK కణాలతో పోల్చినప్పుడు. మరోవైపు, IL-2 చికిత్స చేయని NK కణాలలో CD300c యొక్క క్రాస్-లింకింగ్ ఎటువంటి ముఖ్యమైన ప్రభావాలను చూపించలేదు.

Image

శుద్ధి చేయబడిన NK కణాలు చికిత్స చేయబడలేదు లేదా IL-2 తో ముందే చికిత్స చేయబడ్డాయి మరియు NK సెల్ విధులను అంచనా వేయడానికి ఐసోటైప్ లేదా యాంటీ సిడి 300 సి (క్లోన్ TX45) తో క్రాస్-లింక్ చేయబడ్డాయి. ( ) జీబ్రా ప్లాట్లు CD56 ప్రకాశవంతమైన NK కణాల నుండి వివిధ సైటోకిన్లు మరియు డీగ్రాన్యులేషన్ మార్కర్ల (CD107a / b) ఉత్పత్తిని సూచిస్తాయి, ఇది అంజీర్ 1 లో ఉన్నట్లుగా ఉంటుంది (CD56 ప్రకాశవంతమైన CD16 నెగ్ గా గేట్ చేయబడింది). ( బి ) బార్ గ్రాఫ్‌లు సైటోకైన్‌లను ఉత్పత్తి చేసే CD56 ప్రకాశవంతమైన NK కణాల శాతాన్ని సూచిస్తాయి మరియు వివిధ ఉద్దీపన పరిస్థితుల తర్వాత CD107a / b ను వ్యక్తీకరిస్తాయి. డేటా కనీసం 4 దాతల నుండి స్వతంత్ర ప్రయోగాల నుండి. ( సి ) శుద్ధి చేయబడిన ఎన్‌కె కణాలు చికిత్స చేయబడలేదు లేదా ఐఎల్ -2 తో ముందే చికిత్స చేయబడ్డాయి మరియు ఐసోటైప్ లేదా యాంటీ సిడి 300 సి (క్లోన్ టిఎక్స్ 45) తో క్రాస్‌లింక్ చేయబడ్డాయి మరియు ఐఎల్ -12 మరియు ఐఎల్ -18 లేకపోవడం లేదా ఉనికిలో ఉన్నాయి. ఎగువ ప్యానెల్ IFN-γ + CD56 ప్రకాశవంతమైన NK కణాల శాతాన్ని చూపిస్తుంది. దిగువ ప్యానెల్ MFI IFN-CD + CD56 ప్రకాశవంతమైన NK కణాలలో రెట్లు పెరుగుదలను సూచిస్తుంది. ఎడమ వైపున ఉన్న Y అక్షం తెలుపు పట్టీలు మరియు తెలుపు చిహ్నాలకు అనుగుణంగా ఉంటుంది, కుడి వైపున Y అక్షం నల్ల బార్లు మరియు నల్ల చిహ్నాల కోసం ఉంటుంది. డేటా 4 దాతల నుండి స్వతంత్ర ప్రయోగాల నుండి. లోపం పట్టీలు సగటు ± SEM ను సూచిస్తాయి.

పూర్తి పరిమాణ చిత్రం

IL-2 ప్రీ-యాక్టివేషన్ తర్వాత IFN-γ ఉత్పత్తి చేసే కణాలలో కొద్ది శాతం మేము గమనించినప్పటికీ, IL-2 యాక్టివేట్ చేసిన CD56 ప్రకాశవంతమైన NK కణాలలో IFN-γ స్రావం యొక్క CD300c మధ్యవర్తిత్వ సిగ్నలింగ్ ప్రభావం స్పష్టంగా మరియు ఉచ్ఛరించబడలేదు. NK కణాలు 39 ద్వారా IFN-cells ఉత్పత్తికి IL-12 మరియు IL-18 ముఖ్యమైన మోనోకైన్‌లు కాబట్టి, IL-2 ద్వారా IFN-γ ఉత్పత్తిని ప్రేరేపించడంలో CD300c యొక్క క్రాస్‌లింక్ IL-12 మరియు / లేదా IL-18 తో కలిసిపోవచ్చు అని మేము hyp హించాము. -డివేటెడ్ CD56 ప్రకాశవంతమైన NK కణాలు. అందువల్ల, వేరే ప్రయోగాలలో, సిడి 300 సి యొక్క వ్యక్తీకరణను నియంత్రించడానికి శుద్ధి చేసిన ఎన్‌కె కణాలను ఐఎల్ -2 తో చికిత్స చేసి, ఆపై ఐఎల్ -12 మరియు ఐఎల్ -18 సమక్షంలో లేదా లేకపోవడంతో సిడి 300 సి యాంటీ మోనోక్లోనల్ యాంటీబాడీస్‌తో క్రాస్‌లింక్ చేయబడింది. IL-12 మాత్రమే IFN-γ స్రావాన్ని ప్రేరేపించగలదు, NK కణాలు ఏకకాలంలో CD300c యాంటీబాడీ (Fig. 4C- టాప్) తో క్రాస్‌లింక్ చేయబడినప్పుడు మేము గణనీయమైన పెరుగుదలను కనుగొన్నాము. IL-18 సమక్షంలో కణాలను యాంటీ-సిడి 300 సి మోనోక్లోనల్ యాంటీబాడీస్‌తో క్రాస్‌లింక్ చేసినప్పుడు ఈ ప్రభావాలు గమనించబడలేదు. రెండు మోనోకైన్‌లతో NK కణాలు ఉత్తేజితమైనప్పుడు, IFN-γ స్రవించే కణాల సంఖ్యపై CD300c మధ్యవర్తిత్వ-సంకేతాల యొక్క గణనీయమైన ప్రభావం లేదు, అయితే మధ్యస్థ పెరుగుదల ద్వారా చూపబడిన విధంగా ప్రతి సెల్ ప్రాతిపదికన IFN-of యొక్క మెరుగైన స్రావాన్ని గమనించాము. IFN-γ ఉత్పత్తి చేసే కణాల ఫ్లోరోసెన్స్ తీవ్రత (MFI) (Fig. 4C- దిగువ). అందువల్ల, యాక్టివేటింగ్ రిసెప్టర్ CD300c CD56 ప్రకాశవంతమైన NK కణాలచే IFN-γ ఉత్పత్తికి సహ-ఉద్దీపన పాత్రను కలిగి ఉంది.

జత చేసిన గ్రాహకాల CD300a మరియు CD300c లను PE మరియు PS లకు అవకలన బంధం

చనిపోయిన కణాల ప్లాస్మా పొర యొక్క బయటి కరపత్రంపై బహిర్గతమయ్యే PE మరియు PS లతో CD300a సంకర్షణ చెందుతుందని మా మునుపటి ప్రచురణలో మేము నిరూపించాము. CD300c యొక్క ఎక్స్‌ట్రాసెల్యులార్ డొమైన్ CD300a కు చాలా సజాతీయంగా ఉన్నందున, CD300c ఈ రెండు అమైనో-ఫాస్ఫోలిపిడ్‌లకు సమానమైన బంధన నమూనాను కలిగి ఉంటుందని మేము hyp హించాము. అందువల్ల, ఈ నివేదికలో మేము సిడి 300 సి యొక్క సామర్థ్యాన్ని పిఎస్ మరియు పిఇలను బహుళ పరీక్షలను ఉపయోగించి బంధించగల సామర్థ్యాన్ని పరిశీలించాము. ఈ విశ్లేషణ కోసం, మేము CD300c ఎక్స్‌ట్రాసెల్యులర్ డొమైన్ మరియు మానవ IgG2 యొక్క Fc భాగాన్ని కలిగి ఉన్న చిమెరిక్ ప్రోటీన్‌ను ఉత్పత్తి చేసాము. మా నివేదించిన ఫలితాలకు అనుగుణంగా 32, ఫ్యూజన్ ప్రోటీన్ CD300a-Ig పెరుగుతున్న సాంద్రతలలో చనిపోయిన కణాలతో బంధిస్తుందని మరియు బైండింగ్ 20 μg / ml వద్ద సంతృప్తమైందని మేము గమనించాము; ప్రతికూల నియంత్రణ ఎటువంటి బైండింగ్ చూపించలేదు (Fig. 5A- టాప్). అదేవిధంగా, CD300c-Ig కూడా చనిపోయిన కణాలతో ఏకాగ్రత-ఆధారిత పద్ధతిలో బంధిస్తుంది కాని CD300a-Ig (Fig. 5A- దిగువ) తో పోలిస్తే కొంతవరకు ఉంటుంది. చనిపోయిన కణాల ఉపరితలంపై ప్లాస్మా పొర అసమానత ప్రధానంగా అమైనో-ఫాస్ఫోలిపిడ్లు PS మరియు PE 40 లను బహిర్గతం చేస్తుంది కాబట్టి, ప్రతి అమైనో-ఫాస్ఫోలిపిడ్‌ను విడిగా బంధించే ఈ రెండు గ్రాహకాల సామర్థ్యాన్ని మేము తరువాత అంచనా వేసాము. ఫ్యూజన్ ప్రోటీన్లను స్వచ్ఛమైన లిపిడ్లకు ఏకాగ్రత ఆధారిత పద్ధతిలో బంధించడాన్ని మేము పరీక్షించాము. CD300c-Ig PS మరియు PE రెండింటినీ ఒకే స్థాయిలో బంధిస్తుండగా, CD300a-Ig ప్రధానంగా PE (Fig. 5B) తో బంధిస్తుంది. నెగటివ్ కంట్రోల్ ప్రోటీన్ LAIR R65K-Ig లిపిడ్లలో దేనికీ ఎటువంటి బంధాన్ని చూపించలేదు. ఫ్యూజన్ ప్రోటీన్లను నెగటివ్ కంట్రోల్ లిపిడ్ ఫాస్ఫాటిడైల్కోలిన్ (పిసి) కు బంధించడం తక్కువ లేదా లేకపోవడం. ఇంకా, పిడి మరియు పిఇలకు సిడి 300 ఎ-ఐజి మరియు సిడి 300 సి-ఇగ్ యొక్క అవకలన బైండింగ్‌ను ధృవీకరించడానికి, మేము ఎల్ 1 చిప్‌లో పిసి, పిఎస్ మరియు పిఇ లిపోజోమ్‌లను స్థిరీకరించడం ద్వారా సర్ఫేస్ ప్లాస్మోన్ రెసొనెన్స్ (ఎస్‌పిఆర్) ప్రయోగాలు చేసాము. పై ఫలితాలకు అనుగుణంగా, CD300a-Ig ప్రధానంగా PE లిపోజోమ్‌లతో బంధిస్తుందని మేము గమనించాము, అయితే CD300c-Ig పిఎస్ మరియు పిఇ లిపోజోమ్‌లతో బంధిస్తుంది. ఆసక్తికరంగా, ఇది CD300a-Ig ను PS కి ప్రదర్శించిన బైండింగ్‌కు సమానంగా ఉంటుంది (Fig. 5C, D). మొత్తంగా, జత చేసిన గ్రాహకాలు CD300a మరియు CD300c లు PS మరియు PE లకు భిన్నమైన బంధన లక్షణాలను కలిగి ఉన్నాయని ఈ ఫలితాలు సూచిస్తున్నాయి.

Image

( ) శుద్ధి చేసిన ఫ్యూజన్ ప్రోటీన్ల CD300a-Ig (టాప్ గ్రాఫ్) మరియు CD300c-Ig (దిగువ గ్రాఫ్) ను చనిపోయిన జుర్కాట్ కణాలకు బంధించడం. CD300a-Ig మరియు CD300c-Ig ప్రోటీన్ల యొక్క ఫ్లోరోక్రోమ్ యొక్క సాంద్రతలు చనిపోయిన జుర్కాట్ కణాలతో పొదిగేవి మరియు తరువాత ఫ్లో సైటోమీటర్‌లో పొందబడ్డాయి. LAIR1 R65K-Ig ఫ్యూజన్ ప్రోటీన్ ప్రతికూల నియంత్రణగా ఉపయోగపడింది. ఫ్యూజన్ ప్రోటీన్ల యొక్క చనిపోయిన కణాలకు బైండింగ్ (MFI) ను గ్రాఫ్‌లు సూచిస్తాయి. డేటా రెండు స్వతంత్ర ప్రయోగాలకు ప్రతినిధి. ( బి ) ఎలిసా అస్సే CD300a-Ig (టాప్ గ్రాఫ్) మరియు CD300c-Ig (బాటమ్ గ్రాఫ్) ఫ్యూజన్ ప్రోటీన్ల సాంద్రతలను పలకలపై పూసిన స్వచ్ఛమైన లిపిడ్‌లకు బంధించడాన్ని చూపిస్తుంది. LAIR1 R65K-Ig ఫ్యూజన్ ప్రోటీన్ ప్రతికూల నియంత్రణగా ఉపయోగపడింది. డేటా 2 స్వతంత్ర ప్రయోగాల ప్రతినిధి. ( సి ) CD300-Ig ఫ్యూజన్ ప్రోటీన్లను లిపోజోమ్‌లకు బంధించడం. పేర్కొన్న కూర్పుల యొక్క లిపోజోమ్‌లను తయారు చేసి, ఎల్ 1 బయోసెన్సర్‌తో కలుపుతారు. CD300a-Ig (టాప్) మరియు CD300c-Ig (దిగువ) యొక్క బైండింగ్ ప్రోటీన్లు L1 సెన్సార్ గుండా వెళ్ళడానికి అనుమతించడం ద్వారా విశ్లేషించబడింది. వక్రతలు ఫ్యూజన్ ప్రోటీన్లను లిపోజోమ్ కోటెడ్ ఎల్ 1 చిప్‌లకు బంధించడాన్ని సూచిస్తాయి. ( డి ) పీఠభూమి విలువల కోసం బైండింగ్ (RU) బార్ గ్రాఫ్‌లో చూపబడింది మరియు లోపం పట్టీలు సగటు ± SEM ను సూచిస్తాయి. LAIR1 R65K-Ig ఫ్యూజన్ ప్రోటీన్ ప్రతికూల నియంత్రణగా ఉపయోగపడింది. చూపిన ఫలితాలు 3 స్వతంత్ర ప్రయోగాల నుండి.

పూర్తి పరిమాణ చిత్రం

పిడి మరియు పిఇ సిడి 56 ప్రకాశవంతమైన ఎన్‌కె కణాల పనితీరును భేదాత్మకంగా నియంత్రిస్తాయి

తరువాత, లిపిడ్లు పిసి, పిఎస్ మరియు పిఇలతో పరస్పర చర్యకు ప్రతిస్పందనగా ఎన్కె కణాల యొక్క క్రియాత్మక పరిణామాలను అర్థం చేసుకోవడం మా దృష్టి. NK కణాలు శుద్ధి చేయబడ్డాయి మరియు చికిత్స చేయబడలేదు లేదా పున omb సంయోగం చేసిన IL-2 తో ముందే చికిత్స చేయబడ్డాయి. Expected హించినట్లుగా, ఈ ప్రయోగాల సమూహంలో, మేము తక్కువ సంఖ్యలో TNF-α + మరియు MIP-1α +, అలాగే డీగ్రాన్యులేటింగ్ (CD107a / b) IL-2 ప్రీ-యాక్టివేట్ చేసిన CD56 ప్రకాశవంతమైన NK కణాలను ప్లేట్లపై కల్చర్ చేసినప్పుడు గమనించాము. నెగటివ్ కంట్రోల్ లిపిడ్ పిసితో పూత పూయబడింది, అయితే IL-2 ఉత్తేజిత కణాలు ఎటువంటి ప్రభావవంతమైన పనితీరును చూపించలేదు. ఆసక్తికరంగా, PE తో పూసిన పలకలపై IL-2 ప్రీ-స్టిమ్యులేటెడ్ NK కణాలు సైటోకిన్ ఉత్పత్తి మరియు క్షీణత యొక్క గణనీయమైన తగ్గుదలని చూపించాయి, ఇది PE ఒక నిరోధక లిగాండ్ (Fig. 6A, B) అని సూచిస్తుంది. మరోవైపు, ఐఎల్ -2 ప్రీ-యాక్టివేటెడ్ ఎన్‌కె కణాల పిఎస్ స్టిమ్యులేషన్ ఎన్‌కె కణాలను ఉత్పత్తి చేసే మరియు క్షీణించే సైటోకిన్ సంఖ్యను గణనీయంగా పెంచింది, ఇది పిఎస్ యాక్టివేటింగ్ లిగాండ్‌గా పనిచేస్తుందని సూచిస్తుంది (Fig. 6A, B). CD300a తో PE యొక్క పరస్పర చర్య CD300c తో పరస్పర చర్యపై ప్రధానంగా ఉందని ఈ ఫలితాలు సూచిస్తున్నాయి, దీని ఫలితంగా నిరోధక సంకేతాన్ని ఉత్పత్తి చేస్తుంది. అదనంగా, ఐఎల్ -2 ప్రీ-యాక్టివేటెడ్ ఎన్‌కె కణాలపై పిఎస్ చేత సిడి 300 సి యొక్క క్రాస్‌లింక్ చేయడం సిడి 300 ఎ యొక్క క్రాస్‌లింకింగ్‌ను అధిగమిస్తుంది, దీని ఫలితంగా సానుకూల సంకేతం వస్తుంది.

Image

( ) జీబ్రా ప్లాట్లు సిడి 56 ప్రకాశవంతమైన ఎన్‌కె కణాల నుండి వివిధ సైటోకిన్లు మరియు డీగ్రాన్యులేషన్ మార్కర్ల (సిడి 107 ఎ / బి) స్రావాన్ని సూచిస్తాయి, ఇది అంజీర్ 1 లో ఉన్నట్లుగా (సిడి 56 ప్రకాశవంతమైన సిడి 16 నెగ్ గా గేట్ చేయబడింది) సూచించిన పరిస్థితులలో ప్రేరేపించబడింది. ( బి ) బార్ గ్రాఫ్‌లు TNF-α, MIP-1α మరియు CD107a / b పాజిటివ్ CD56 ప్రకాశవంతమైన NK కణాల శాతాన్ని సూచిస్తాయి. డేటా 4 దాతల నుండి స్వతంత్ర ప్రయోగాల నుండి. లోపం పట్టీలు సగటు ± SEM ను సూచిస్తాయి.

పూర్తి పరిమాణ చిత్రం

చర్చా

NK సెల్ ప్రతిస్పందనలు సక్రియం మరియు నిరోధక గ్రాహకాల ద్వారా సమతుల్యం చేయబడతాయి. గ్రాహకాల వ్యక్తీకరణ మరియు పనితీరు వివిధ సైటోకిన్ ఉద్దీపనలచే నియంత్రించబడుతుంది. ఈ అధ్యయనంలో, CD300c యొక్క వ్యక్తీకరణ నమూనాను మేము పరిశోధించాము, ఇది CD300 కుటుంబానికి చెందిన యాక్టివేటింగ్ రిసెప్టర్, ఇది లిపిడ్లను వాటి లిగాండ్లుగా గుర్తిస్తుంది. IL-2 మరియు IL-15 ద్వారా సిగ్నలింగ్ CD56 ప్రకాశవంతమైన NK కణాలపై CD300c యొక్క వ్యక్తీకరణను ప్రేరేపించింది, కాని STAT5 ను కలిగి ఉన్న ఒక యంత్రాంగంలో CD56 మసక జనాభాపై కాదు. ఆసక్తికరంగా, NK కణాలు 41 యొక్క IL-2 మధ్యవర్తిత్వ క్రియాశీలత యొక్క శక్తివంతమైన నియంత్రకం, CD56 ప్రకాశవంతమైన NK కణాలపై CD300c యొక్క IL-2 / IL-15 ఆధారిత వ్యక్తీకరణను నిరోధిస్తుంది, ఇది IL-4 ని నిరోధించే సామర్థ్యానికి అనుగుణంగా ఉంటుంది IL-2 మానవ T కణాలపై STAT5 క్రియాశీలతను ప్రేరేపించింది 38 .

మానవులలో, అనుకూల రోగనిరోధక శక్తి 15 లో CD56 ప్రకాశవంతమైన NK సెల్ ఉపసమితి ముఖ్యమైన పాత్ర పోషిస్తుందని తేలింది. CD56 ప్రకాశవంతమైన NK కణాలు, ద్వితీయ లింఫోయిడ్ అవయవాలలో అధికంగా ఉన్న NK సెల్ జనాభా, సమృద్ధిగా సైటోకిన్‌లను ఉత్పత్తి చేసే సామర్థ్యాన్ని కలిగి ఉంటాయి మరియు అందువల్ల అనుకూల రోగనిరోధక ప్రతిస్పందనల సమయంలో (9, 12, 20) నియంత్రణ పాత్రను కలిగి ఉన్నాయని భావిస్తారు. ద్వితీయ శోషరస కణుపులలోని NK కణాల అభివృద్ధిలో, ఒక CD34 + పూర్వగామి జనాభా గుర్తించబడింది మరియు IL-2 లేదా IL-15 తో ఉద్దీపనపై CD56 ప్రకాశవంతమైన NK కణాలుగా విభేదిస్తుంది. ఇంకా, ఈ కణాలు శోషరస కణుపుల యొక్క T సెల్ సుసంపన్న ప్రాంతాలలో నివసిస్తాయి. యాంటిజెన్-యాక్టివేట్ చేసిన టి కణాలు IL-2 ను స్రవిస్తాయి కాబట్టి, T సెల్ యాక్టివేషన్ యొక్క పర్యవసానంగా పొరుగున ఉన్న CD56 ప్రకాశవంతమైన NK కణాలు వాటి ఉపరితలంపై CD300c వ్యక్తీకరణను నియంత్రిస్తాయి. ట్రాన్స్‌వెల్ అస్సేస్ నుండి వచ్చిన డేటా CD56 ప్రకాశవంతమైన NK కణాలపై CD300c యొక్క ప్రేరణలో IL-2 నుండి పొందిన సక్రియం చేయబడిన CD4 + T కణాల పాత్రను ధృవీకరిస్తుంది.

CD300c యొక్క క్రాస్‌లింక్ 35, 42 శోథ నిరోధక ప్రతిస్పందనలను ప్రేరేపించడానికి మానవ మోనోసైట్‌లను సక్రియం చేస్తుందని గతంలో నిరూపించబడింది. ఈ నివేదికలో, CD300c కి వ్యతిరేకంగా ఒక యాంటీబాడీ సైటోకైన్ స్రావం మరియు డీగ్రాన్యులేషన్‌ను IL-2 ప్రీ-యాక్టివేటెడ్ CD56 ప్రకాశవంతమైన NK కణాలలో మాత్రమే ప్రేరేపించగలదని మేము చూపించాము. IL-2 ప్రీ-యాక్టివేటెడ్ CD56 ప్రకాశవంతమైన NK కణాలచే TNF-α, MIP1-α మరియు డీగ్రాన్యులేషన్ (CD107a / b) యొక్క ప్రేరణ CD300c యొక్క క్రాస్లింక్ చేసిన తరువాత బలంగా మెరుగుపరచబడింది. మరోవైపు, IL-2 ప్రీ-యాక్టివేటెడ్ CD56 ప్రకాశవంతమైన NK కణాలపై CD300c క్రాస్-లింక్ చేసిన తరువాత IFN-duction ప్రేరణను తగ్గించారు. అయినప్పటికీ, IL-2 ప్రీ-యాక్టివేటెడ్ కణాలపై అధిక మొత్తంలో IFN-produce ను ఉత్పత్తి చేయడానికి CD300c మధ్యవర్తిత్వ సంకేతాలు IL-12 మరియు IL-18 లతో సినర్జైజ్ చేయబడ్డాయి. ఇటీవల, ఎన్‌కె కణాలు మరియు ఇతర మైలోయిడ్ కణాల మధ్య క్రాస్‌స్టాక్, ముఖ్యంగా డెన్డ్రిటిక్ కణాలు మరియు మాక్రోఫేజెస్, పరస్పర క్రియాశీలత ద్వారా పరస్పరం ప్రయోజనం పొందుతాయని తేలింది. మైలోయిడ్ కణాల నుండి పొందిన సైటోకిన్లు, ఐఎల్ -12, ఐఎల్ -15 మరియు ఐఎల్ -18, ఎన్‌కె కణాలను సక్రియం చేస్తాయి. పోస్ట్ యాక్టివేషన్, ఎన్‌కె కణాలు టిఎన్ఎఫ్- as వంటి ప్రో-ఇన్ఫ్లమేటరీ సైటోకిన్‌లను స్రవిస్తాయి, ఇవి డిసి పరిపక్వతను ప్రారంభిస్తాయి మరియు 7, 11 ఇన్ఫ్లమేటరీ మాక్రోఫేజ్‌లను సక్రియం చేసే ఐఎఫ్ఎన్- . ఈ ప్రత్యేక అధ్యయనంలో, CD56 ప్రకాశవంతమైన NK కణాలపై CD300c యొక్క ప్రత్యేకమైన వ్యక్తీకరణ మరియు పనితీరు ద్వితీయ లింఫోయిడ్ అవయవాలలో ఎండోజెనస్ T- సెల్ ఉత్పన్నమైన IL-2 మరియు సైటోకైన్స్ (IL-) సమక్షంలో ఒక ముఖ్యమైన సహ-ఉద్దీపన పాత్రను పోషిస్తుందని మేము age హించాము. 12, IL-15 మరియు IL-18) యాంటిజెన్ ప్రెజెంటింగ్ కణాలు (APC లు) నుండి తీసుకోబడ్డాయి.

NK కణాలపై సక్రియం మరియు నిరోధక గ్రాహకాల యొక్క అనేక వాటిలో, జత చేసినవి ఎక్స్‌ట్రాసెల్యులార్ డొమైన్‌లో అధిక సజాతీయ సన్నివేశాలను కలిగి ఉంటాయి మరియు రోగనిరోధక నియంత్రణలో వ్యతిరేక విధులను కలిగి ఉంటాయి. కిల్లర్ సెల్ ఇమ్యునోగ్లోబులిన్ లాంటి గ్రాహకాలు (KIR) కుటుంబం మరియు MHC క్లాస్ I అణువులను గుర్తించే సి-రకం లెక్టిన్ రిసెప్టర్ కుటుంబం ఉత్తమంగా వివరించిన ఉదాహరణలు. మా డేటా జత చేసిన గ్రాహకాలైన CD300a మరియు CD300c లచే ఒకే లిగాండ్ల గుర్తింపును ప్రదర్శించింది, అయినప్పటికీ విభిన్న అనుబంధాలతో. కణ త్వచం 40 రాజీపడినప్పుడు బయటి కరపత్రంపై బహిర్గతమయ్యే లిపిడ్‌లు పిఇ మరియు పిఎస్. మా మునుపటి నివేదికలకు అనుగుణంగా, మా ప్రస్తుత అధ్యయనాలు CD300a ను చనిపోయిన కణాలకు మరియు సంబంధిత అమైనో-ఫాస్ఫోలిపిడ్లు PE మరియు PS లకు బంధించడాన్ని ప్రదర్శించాయి. యాక్టివేట్ రిసెప్టర్ CD300c కోసం ఇదే విధమైన దృగ్విషయం గమనించబడింది. చమత్కార లక్షణం ఏమిటంటే, రెండు గ్రాహకాల మధ్య చనిపోయిన కణాలు మరియు PE ల మధ్య బంధించే బలం చాలా భిన్నంగా ఉంటుంది. CD300a చనిపోయిన కణాలకు మరియు CD300c కన్నా PE కి బలమైన బంధాన్ని ప్రదర్శించింది. మరోవైపు, CD300a మరియు CD300c రెండూ PS కి సమానమైన బంధాన్ని ప్రదర్శించాయి. మా పరిశీలనలకు తకాహషి మరియు ఇతరులు మద్దతు ఇస్తున్నారు మరియు ప్రచురిస్తున్నారు. 42 . అందువల్ల, సక్రియం చేసే గ్రాహక CD300c కు లిగాండ్ సంకర్షణలు దాని నిరోధక ప్రతిరూపం CD300a కన్నా బలహీనంగా ఉన్నాయని తేల్చడం ఆమోదయోగ్యమైనది. పై దృగ్విషయాలు వేర్వేరు కుటుంబాలకు చెందిన ఇతర జత గ్రాహకాలకు అనుగుణంగా ఉంటాయి. ఉదాహరణకు, KIR2DL1 (KIR కుటుంబం) మరియు CD94 / NKG2A (C- రకం లెక్టిన్ కుటుంబం) వరుసగా HLA-C Lys80 మరియు HLA-E లతో ఎక్కువ బంధాన్ని కలిగి ఉంటాయి, వాటి క్రియాశీలక కౌంటర్ భాగాలు KIR2DS1 మరియు CD94 / NKG2C 43 కన్నా .

మా అధ్యయనాలు CD56 ప్రకాశవంతమైన NK కణాల ద్వారా సైటోకిన్ ఉత్పత్తి మరియు క్షీణతను ప్రేరేపించే PS యొక్క సామర్థ్యాన్ని వివరించాయి. పిఎస్ అపోప్టోటిక్ కణాలపై మాత్రమే కాకుండా, సక్రియం చేయబడిన టి కణాలు, బి కణాలు మరియు మోనోసైట్లు 45, 46, 47 లను కూడా బహిర్గతం చేస్తుందని పరిగణనలోకి తీసుకుంటే, ఇది సిడి 300 ప్రకాశవంతమైన ఎన్‌కె కణాలపై సిడి 300 సి ని నిమగ్నం చేస్తుంది. CD56 మసక NK సెల్ ఉపసమితి 48, 49 తో పోలిస్తే ప్రధానంగా CD56 ప్రకాశవంతమైన NK సెల్ ఉపసమితి ఆటోలోగస్ యాక్టివేటెడ్ టి కణాలను లైస్ చేయగల సామర్థ్యాన్ని కలిగి ఉంది. అంతేకాకుండా, టాన్సిలార్ CD56 ప్రకాశవంతమైన NK కణాలు IFN-γ 50 స్రావం ద్వారా ప్రాధమిక రోగనిరోధక ప్రతిస్పందనల సమయంలో T సెల్ ధ్రువణాన్ని ప్రభావితం చేస్తాయని తేలింది. అందువల్ల, CD56 ప్రకాశవంతమైన NK కణాలపై CD300c ఈ NK కణాలు మరియు ఇతర ఉత్తేజిత ల్యూకోసైట్‌ల మధ్య సంభాషణను సులభతరం చేస్తుంది. గత దశాబ్దంలో, వివిధ స్వయం ప్రతిరక్షక వ్యాధుల సమయంలో సిడి 56 ప్రకాశవంతమైన ఎన్‌కె కణాలు టి సెల్ ప్రతిస్పందనలను నిరోధిస్తాయని ఆధారాలు కూడా ఉన్నాయి. మల్టిపుల్ స్క్లెరోసిస్ (ఎంఎస్) 52 లోని యాక్టివేటెడ్ టి కణాలు మరియు దైహిక ల్యూపస్ ఎరిథెమాటస్ (ఎస్‌ఎల్‌ఇ) 53 లోని పాలిక్లోనల్ యాక్టివేటెడ్ బి కణాలు వంటి క్రియాశీల రోగనిరోధక వ్యవస్థ ద్వారా ఆటో ఇమ్యూన్ వ్యాధుల రోగ నిరూపణలు ప్రభావితమవుతాయి. ఉదాహరణకు, సిడి 25 యాంటీ హ్యూమనైజ్డ్ మోనోక్లోనల్ యాంటీబాడీ అయిన డాక్లుజిమాబ్‌తో ఎంఎస్ రోగుల చికిత్స, సిడి 56 ప్రకాశవంతమైన ఎన్‌కె కణాల ఉపసమితిని ఎంపిక చేస్తుంది మరియు సక్రియం చేయబడిన టి కణాల సైటోటాక్సిసిటీకి బాధ్యత వహిస్తుంది 54 . IL-2 ఉత్తేజిత NK కణాల ద్వారా సక్రియం చేయబడిన T కణాలను చంపడం NKG2D, LFA-1 మరియు TRAIL గ్రాహకాలు 48, 49 కలిగి ఉంటుందని ఇతరులు చూపించారు. అదేవిధంగా, సక్రియం చేయబడిన టి కణాల హత్యలో, సిడి 300 సి ఇతర గ్రాహకాలతో పాటు, ఒక ముఖ్యమైన పాత్రను కలిగి ఉండటం చాలా సాధ్యమే.

పిఎస్ యాక్టివేటింగ్ ఫంక్షన్‌కు విరుద్ధంగా, పిఇ IL-2 ప్రీ-యాక్టివేటెడ్ సిడి 56 ప్రకాశవంతమైన ఎన్‌కె కణాల డీగ్రాన్యులేషన్ మరియు సైటోకిన్ ప్రతిస్పందనలో ప్రతికూల ప్రతిస్పందనను ప్రేరేపించిందని మేము గమనించాము. మా మునుపటి అధ్యయనాలు 32 మరియు ప్రస్తుత డేటా CD300a PE కి బలంగా బంధిస్తుందని మరియు PS కి బంధించడం బలహీనంగా ఉందని నిరూపిస్తుంది, అయితే CD300c అదేవిధంగా PE మరియు PS లను బంధిస్తుంది. మరోవైపు, CD300a PE ను CD300c కన్నా బలంగా బంధిస్తుంది, అయితే రెండు గ్రాహకాలు PS ని బంధిస్తాయి (Fig. 5). PE తో పరస్పర చర్య ప్రతికూల సంకేతాన్ని ఇస్తుందని was హించినప్పటికీ, IL-2 (లేదా IL-15) ప్రీ-యాక్టివేట్ చేసిన CD56 ప్రకాశవంతమైన NK కణాలు PS తో సంభాషించినప్పుడు ఏమి ఆశించాలో మాకు తెలియదు. ఆసక్తికరంగా, పిఎస్‌కు ప్రతిస్పందనగా కణాలు సైటోకిన్‌లను డి-గ్రాన్యులేట్ చేసి ఉత్పత్తి చేస్తాయి, ఈ సందర్భంలో సానుకూల సిగ్నల్ (సిడి 300 సి-మెడియేటెడ్) ప్రతికూల సిగ్నల్ (సిడి 300 ఎ-మెడియేటెడ్) ను అధిగమిస్తుందని సూచిస్తుంది. CD56 ప్రకాశవంతమైన ఉపసమితిలో CD300c వ్యక్తీకరణను ప్రేరేపించడానికి మా పరీక్షల్లో ఉపయోగించే NK కణాలు ఎల్లప్పుడూ IL-2 (లేదా IL-15) తో ముందే సక్రియం చేయబడతాయని గమనించడం ముఖ్యం. అందువల్ల ప్రీ-యాక్టివేషన్ లేనప్పుడు పిఎస్‌తో పరస్పర చర్య నిరోధక సంకేతాన్ని ఇస్తుందో లేదో మాకు తెలియదు. దురదృష్టవశాత్తు, కొత్తగా వివిక్త CD56 ప్రకాశవంతమైన NK కణాలతో ప్రయోగాలు చేయలేవు ఎందుకంటే అవి CD300c యొక్క సెల్ ఉపరితలంపై వ్యక్తీకరించవు (లేదా చాలా తక్కువ స్థాయిని వ్యక్తపరుస్తాయి). However, to avoid the co-stimulatory effect of IL-2, cells were rested for 24 hours after cytokine treatment, which may suggest that CD56 bright NK cells expressing CD300c do not need to be in a highly activated state to produce cytokines and degranulate after encountering PS.

The finding that two phospholipids, PS and PE, are metabolically related 40, but differentially regulate the functions of CD56 bright NK cells through their interaction with CD300a and CD300c clearly indicate that further studies are necessary to perform in-depth characterization of the immune-regulatory roles of these paired receptors on NK cells. CD300a and CD300c on CD56 bright NK cells, with their opposing functions, will modulate the threshold for cell activation after interacting with PE and PS expressing dead and activated cells. Consequently, this might play an important role in maintaining the homeostasis of secondary lymphoid organs during the cross-talk between activated T cells and CD56 bright NK cells.

పద్ధతులు

Primary Cells

Leukapheresis blood packs from healthy donors were obtained under an institutional review board-approved protocol at the National Institutes of Health. All donors provided written informed consent. All the cell isolation methods were carried out in accordance with the approved laboratory guidelines. Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were obtained by ficoll density centrifugation. NK cells were purified from PBMCs using a negative selection method. Naïve CD4 + T cells were isolated from PBMCs using a double purification step involving the removal of CD25 + regulatory cells and then using a negative selection method for the purification of naïve CD4 + T cells. All the kits were purchased from Stem Cell Technologies and isolated using RoboSep. Cells were cultured in Iscove´s Modified Dulbecco´s Medium (IMDM) supplemented with 10% fetal-bovine serum, L-glutamine, sodium pyruvate and non-essential amino acids.

ప్రతిరోధకాలు మరియు కారకాలు

Fluorochrome-labeled antibodies used for flow cytometric analyses were obtained from the following vendors: anti-CD3 (UCHT1), anti-CD16 (eBioCB16), anti-CD56 (CMSSB), anti-CD107a (eBioH4A3), anti-CD107b (eBioH4B4), anti-CD300c (TX45), anti-TNFα (MAb11), anti-MIP1α (PFFM3) and anti-CD69 (FN50) were from eBiosciences and anti-IFN-γ (B27) was from BD Biosciences. Purified antibodies anti-human IL-2 (AB12-3G4), mouse IgG2a κ isotype (eBM2a), mouse IgG1 κ (MOPC-21) and anti-CD300c (TX45) were obtained from eBiosciences. For the real time PCR experiments, primers for CD300A, CD300C and 18sRNA genes were purchased from SA Biosciences. STAT5 inhibitor N′-((4-Oxo-4H-chromen-3-yl)methylene)nicotinohydrazide was purchased from Calbiochem/EMD Millipore. Recombinant IL-2 was obtained from National Cancer Institute, Frederick, MD. Cytokines IL-12, IL-15 and IL-4 are from R&D Systems, IL-18 is from Medical and Biological Laboratories (MBL) and IL-21 is from Peprotech. Phospholipids 1-palmitoyl-2-oleoyl (PO) phosphatidylserine (POPS) (PS), phosphatidylethanolamine (POPE) (PE) and phosphatidylcholine (POPC) (PC) were purchased from Avanti Polar Lipids.

NK cell Stimulation

Purified NK cells were stimulated with cytokines IL-2 (100–200 U/ml), IL-15 (10 ng/ml), IL-4 (50 ng/ml), IL-12 (10 ng/ml), IL-18 (100 ng/ml) and IL-21 (50 ng/ml) for 40 hours. In the inhibition assays, vehicle DMSO (Sigma) and STAT5 inhibitor were used at 250 nM concentrations during NK cell stimulation. Post incubation, all the respective samples were stained for multiple surface markers and acquired in either LSR-II or Fortessa X-20 (BD Biosciences). Lymphocytes were electronically gated based on forward and side scatter parameters, and NK cells were further gated based on the expression of CD3, CD56 and CD16 (CD3 CD56 + CD16 +/− ). Flow cytometric data were analyzed using FlowJo software (Tree Star).

Transwell Assays

Purified NK cells were cultured in the inner compartment and the naïve CD4+ T cells were in the outer compartment in a Transwell 24-well plate. The CD4+ T cells were activated with human T-activator CD3/CD28 Dyna beads (Life Technologies). As a control NK cells were also incubated with resting CD4+ T cells in the trans-well system. When indicated, the isotype control IgG2a κ and anti-human IL-2 (eBiosciences) were added at a concentration of 10 μg/ml to the activated T cells compartment. After 2 days of incubation, the NK cells in the inner compartment were observed in a bright field microscope for the cluster formation and later the cells were harvested and analyzed for CD300c surface expression. Recombinant IL-2 (100–200 U/ml) was used as a positive control.

Functional Experiments

Freshly isolated NK cells were stimulated with recombinant IL-2 for 40 hours, washed thoroughly and starved from IL-2 for 24 hours. For antibody cross-linking experiments, both untreated and IL-2 pre-stimulated NK cells were cross-linked with two different monoclonal antibodies; isotype control (MOPC-21) and anti-CD300c (TX45) plated on a 24-well plate at 10 μg/ml concentrations. For lipid stimulation experiments, the lipids PC, PS and PE were diluted in 100% methanol and air-dried. Later the IL-2 starved NK cells were incubated with the lipid-coated plates. After overnight incubation, the NK cells were stained with appropriate surface receptors and intracellular cytokines. The anti-CD107a/b monoclonal antibodies and monensin (Golgi-stop, a protein transport inhibitor) were added during the culture for the last six hours before harvesting. Subsequently, the cells were acquired in a flow cytometer (BD LSR-II) and analyzed by using FlowJo software (Tree Star).

Binding Assays

The Ig fusion proteins were constructed, purified and fluorescently labeled as previously described 55 . The cell binding assay protocol was followed as mentioned in our previous report 32 . Briefly, UV-treated Jurkat cells were incubated with the Ig fusion proteins in the presence of binding buffer (10 mM HEPES pH 7.4, 140 mM NaCl, 2.5 mM CaCl 2 and 2 mM MgCl 2 ) for 45 minutes on ice and washed twice with wash buffer (PBS containing 1% of FCS) and re-suspended in PBS for flow cytometric analysis. Cells were also stained with Annexin V-APC (eBiosciences) and 7AAD (Beckmann Coulter) to differentiate between dead and live cells. ELISA binding studies were performed as previously described 32 . Briefly, purified lipids PC, PS and PE were diluted in 100% methanol and air-dried. After subsequent washes and blocking, the wells were incubated with different human Ig fusion proteins, washed and incubated with anti-human Ig (Fcγ specific) antibody coupled to horseradish peroxidase HRP (Jackson Immuno Research) for one hour at RT. The peroxidase activity was analyzed by using TMB substrate (ImmunoPure TMB Substrate Kit-Pierce) and the absorbance was measured at 450 nm in a spectrophotometer. The Surface Plasmon Resonance (SPR) analysis protocol was followed as described earlier and performed in Biacore T200 32 . Briefly, the liposomes composed of various lipids PC, PS and PE were captured on the L1 sensor chip and the human-Ig fusion proteins were injected and carried in flow to study their binding to liposomes. BIACORE T200 Control Software and BIAevaluation Software were used to analyze the SPR experiments.

గణాంక విశ్లేషణ

Data were analyzed using GraphPad Prism software. The data were plotted as bar graphs representing the average ± standard error of the mean (SEM). Pair wise comparisons were examined by a paired Student's t -test. NS: not significant; * P < 0.05, ** P < 0.01 *** P < 0.001.

అదనపు సమాచారం

How to cite this article : Dimitrova, M. et al . CD300c is uniquely expressed on CD56 bright Natural Killer Cells and differs from CD300a upon ligand recognition. సైన్స్. Rep. 6, 23942; doi: 10.1038/srep23942 (2016).

అనుబంధ సమాచారం

PDF ఫైళ్లు

  1. 1.

    అనుబంధ సమాచారం

వ్యాఖ్యలు

వ్యాఖ్యను సమర్పించడం ద్వారా మీరు మా నిబంధనలు మరియు సంఘ మార్గదర్శకాలకు కట్టుబడి ఉండాలని అంగీకరిస్తున్నారు. మీరు దుర్వినియోగమైనదాన్ని కనుగొంటే లేదా అది మా నిబంధనలు లేదా మార్గదర్శకాలకు అనుగుణంగా లేనట్లయితే దయచేసి దాన్ని అనుచితమైనదిగా ఫ్లాగ్ చేయండి.