3 డి ఫ్లోరోసెన్స్ మైక్రోగ్రాఫ్‌ల విజువలైజేషన్ మరియు పరిమాణాత్మక విశ్లేషణ కోసం 2 డి మ్యాప్ అంచనాలు | శాస్త్రీయ నివేదికలు

3 డి ఫ్లోరోసెన్స్ మైక్రోగ్రాఫ్‌ల విజువలైజేషన్ మరియు పరిమాణాత్మక విశ్లేషణ కోసం 2 డి మ్యాప్ అంచనాలు | శాస్త్రీయ నివేదికలు

Anonim

విషయము

  • 3-డి పునర్నిర్మాణం
  • సాఫ్ట్వేర్
  • ఈ వ్యాసానికి ఒక లోపం 21 సెప్టెంబర్ 2015 న ప్రచురించబడింది

ఈ వ్యాసం నవీకరించబడింది

నైరూప్య

ఐదు-డైమెన్షనల్ (5 డి) ఫ్లోరోసెన్స్ మైక్రోస్కోపీ ఇమేజ్ డేటాను పూర్తి-కంటెంట్ 2 డి మ్యాప్‌లలో ఖచ్చితంగా ప్రొజెక్ట్ చేయడానికి ఉచితంగా లభించే సాఫ్ట్‌వేర్ మ్యాప్ 3-2 డిని మేము పరిచయం చేస్తున్నాము. కార్టోగ్రాఫిక్ మ్యాప్‌లపై భూమి యొక్క ప్రొజెక్షన్ మాదిరిగానే, మ్యాప్ 3-2 డి చిత్రాల స్టాక్ నుండి ఉపరితల సమాచారాన్ని ఒకే, నిర్మాణాత్మకంగా అనుసంధానించబడిన మ్యాప్‌లోకి తెస్తుంది. క్షీరద మరియు ఈస్ట్ కణాలు మరియు దిగ్గజం యూనిలామెల్లార్ వెసికిల్స్ ఉపయోగించి స్థిరమైన మరియు డైనమిక్ ప్రత్యక్ష నమూనాలలో గోళాకార మరియు అసమాన ఉపరితలాల విజువలైజేషన్ మరియు పరిమాణాత్మక విశ్లేషణల కోసం మేము దాని వర్తమానతను ప్రదర్శిస్తాము. మ్యాప్ 3-2 డి సాఫ్ట్‌వేర్ //www.zmbh.uni-heidelberg.de//Central_Services/Imaging_Facility/Map3-2D.html వద్ద లభిస్తుంది.

పరిచయం

లైట్ మైక్రోస్కోపీలో ప్రాదేశిక ఇమేజింగ్ చేయడానికి మూడు కొలతలు పరిగణించాల్సిన అవసరం ఉంది, అవి పార్శ్వ (X మరియు Y) మరియు అక్షసంబంధ (Z) కొలతలు 1 . అటువంటి 3D ఇమేజ్ డేటాను ప్రదర్శించడానికి (ఉదా. కాన్ఫోకల్ Z- సిరీస్ నుండి), ఒక సమయంలో ఒక చిత్రాన్ని చూపించే 2D చిత్రాల స్టాక్‌లు లేదా 2D అంచనాలు (గరిష్ట, మొత్తం, సగటు తీవ్రతలు లేదా ఆకృతి-ఆధారిత వాల్యూమ్ రెండరింగ్‌లు, ఉపరితలాలు లేదా ఆర్థోస్లైస్‌లు ) సాధారణంగా ప్రదర్శిస్తారు. మూడవ ఎంపిక ఏమిటంటే ఇమేజ్ గ్యాలరీల వాడకం, ఇది ఒకదానికొకటి పక్కన ఉన్న చిత్రాల సేకరణను ఒకదానికొకటి డిస్‌కనెక్ట్ చేయబడిన మాంటేజ్ రూపంలో ఉంచుతుంది. పైన పేర్కొన్న అన్ని ప్రెజెంటేషన్ పద్ధతులు వాటి ప్రయోజనాలను కలిగి ఉన్నప్పటికీ, అవన్నీ పూర్తి 3D ఉపరితల సమాచార కంటెంట్‌ను ఒకే, నిర్మాణాత్మకంగా అనుసంధానించబడిన 2D ఇమేజ్‌గా ప్రదర్శించడంలో విఫలమవుతాయి (అనుబంధ Fig. 1). పర్యవసానంగా, ఈ ప్రదర్శన ఎంపికలలో దేనితోనైనా, కోల్పోయే లేదా మార్చబడిన కొన్ని ఇమేజ్ కంటెంట్ ఎల్లప్పుడూ ఉంటుంది. నిర్మాణాత్మకంగా అనుసంధానించబడిన, బహుళ చిత్రాలు-విస్తరించే సంకేతాల గుణాత్మక మరియు పరిమాణాత్మక విశ్లేషణల కోసం ఇది ఒక నిర్దిష్ట సవాలును ప్రదర్శిస్తున్నందున, మేము అలాంటి పరిమితులను అధిగమించడానికి ప్రయత్నించాము. 3 డి ఫ్లోరోసెన్స్ మైక్రోస్కోపీ నుండి ఉపరితల డేటాను దృశ్యమానం చేయడానికి మేము మ్యాట్‌లాబ్ (మ్యాథ్‌వర్క్స్) లో 'మ్యాప్ 3-2 డి' అని పిలిచాము. ప్రాదేశిక ఫ్లోరోసెన్స్ ఇమేజ్ డేటాను ఒకే నిర్మాణాత్మకంగా అనుసంధానించబడిన మ్యాప్‌లోకి తెరవడానికి కార్టోగ్రఫీలో ఉపయోగించే మ్యాప్ ప్రొజెక్షన్ అల్గారిథమ్‌లను మేము అమలు చేసాము (Fig. 1). జీబ్రాఫిష్ పిండాల 2 యొక్క నిల్వ-డిమాండ్ సెలెక్టివ్-ప్లేన్ ఇల్యూమినేషన్ మైక్రోస్కోపీలో డేటా రేటును తగ్గించడానికి ఇదే విధమైన విధానం ఇటీవల ప్రచురించబడింది. ఇక్కడ, కణాలు మరియు ఉపకణ భాగాలు వంటి సాధారణంగా ఉపయోగించే (మరియు తరచుగా చిన్న-స్థాయి) అపారదర్శక జీవ నమూనాల పరిమాణాత్మక విశ్లేషణలకు మ్యాప్ అంచనాల అనువర్తన పరిధిని మేము విస్తరిస్తాము. మ్యాప్ అంచనాల కోసం ఈ క్రింది ప్రమాణాలను నెరవేర్చగల సాఫ్ట్‌వేర్‌ను అభివృద్ధి చేయడమే మా లక్ష్యం: (ఎ) 3 డి ఫ్లోరోసెన్స్ మైక్రోస్కోపీ డేటా యొక్క విజువలైజేషన్ గోళాకార మరియు దీర్ఘవృత్తాకార ఉపరితలాలకు మాత్రమే కాకుండా, ఇండెంటేషన్లు మరియు ప్రోట్రూషన్లను కలిగి ఉన్న సాపేక్షంగా అసమాన ఉపరితలాలకు కూడా, (బి) ఎంపిక అసలు 3D ఇమేజ్ డేటాతో క్రాస్ రిఫరెన్స్ చేయడం ద్వారా మరింత పరిమాణీకరణ మరియు విశ్లేషణ కోసం మ్యాప్‌లో ఆసక్తి ఉన్న ప్రాంతాలను ఎంచుకోవడం, (సి) సమయం (టి) పరిమాణం అమలు, డైనమిక్ 3D ప్రక్రియలను అంచనా వేయడం మరియు (డి) ప్రదర్శన ప్రోగ్రామింగ్ నేపథ్యం అవసరం లేకుండా, ఆసక్తి ఉన్న ప్రతి ఒక్కరికీ ఉచితంగా, ప్లాట్‌ఫామ్-స్వతంత్ర స్టాండ్-అలోన్ అప్లికేషన్‌గా ఉపయోగించడానికి సిద్ధంగా ఉన్న సాఫ్ట్‌వేర్.

Image

ఫ్లోరోసెన్స్ మైక్రోస్కోపీ 3D (5D వరకు) ఇమేజ్ స్టాక్స్ (ఎడమ) మ్యాప్ 3-2 డి సాఫ్ట్‌వేర్ (మధ్య) కోసం ఇన్‌పుట్‌గా పనిచేస్తాయి. ఆసక్తి ఉన్న వస్తువు యొక్క మొత్తం ఉపరితల డేటా 2D మ్యాప్ ఇమేజ్ (కుడి) పై అంచనా వేయబడుతుంది. మ్యాప్ 3-2 డి సాఫ్ట్‌వేర్ ఇమేజ్ స్టాక్ యొక్క అన్ని పిక్సెల్ సమాచారాన్ని నమోదు చేస్తుంది (తీవ్రత, స్టాక్ లోపల స్థానం, రిఫరెన్స్ ఎలిప్సోయిడ్‌కు సంబంధించి స్థానం). ఇమేజ్ స్టాక్ యొక్క సింగిల్ (బ్లూ లైన్స్) లేదా బహుళ లేయర్స్ (ఆరెంజ్ లైన్స్) కు అనుగుణమైన ఆసక్తి ఉన్న ప్రాంతాలను మ్యాప్ ప్రొజెక్షన్‌లో అసలు డేటాపై క్రాస్-రిఫరెన్సింగ్ మరియు పరిమాణాత్మక విశ్లేషణ కోసం ఎంచుకోవచ్చు మరియు దీనికి విరుద్ధంగా.

పూర్తి పరిమాణ చిత్రం

వివిధ రకాలైన శాస్త్రీయంగా ఆసక్తికరమైన ఉపరితలాలతో పాటు కృత్రిమంగా సృష్టించిన ఇమేజ్ స్టాక్‌లతో (Fig. 2) విస్తృతమైన జీవ నమూనాల నుండి ఇమేజ్ సెట్‌లను వర్తింపజేయడం ద్వారా మేము మ్యాప్ 3-2 డి సాఫ్ట్‌వేర్‌ను పరీక్షించాము. సంక్షిప్తంగా, అన్ని జీవ నమూనాలు ఫ్లోరోసెంట్‌గా లేబుల్ చేయబడ్డాయి మరియు అపారదర్శక నమూనా యొక్క పూర్తి ఉపరితల కంటెంట్‌ను పొందడానికి అక్షసంబంధ పరిమాణం (అనగా Z- స్టాక్‌లు) వెంట మైక్రోగ్రాఫ్‌ల శ్రేణిని పొందారు. మ్యాప్ 3-2 డికి ప్రత్యేకమైన 3 డి ఇమేజ్ సముపార్జన విధానాలు అవసరం లేదని చెప్పడం విలువ, అంటే ఇప్పటికే ఉన్న ఇమేజ్ స్టాక్‌లను కూడా విశ్లేషించవచ్చు. ఫైల్ ఫార్మాట్ వలె, మ్యాప్ 3-2 డి సాఫ్ట్‌వేర్ ఇమేజ్ సిరీస్ నుండి ఉపరితల సమాచారాన్ని ఒకదానితో ఒకటి అనుసంధానించబడిన 2 డి మ్యాప్‌లోకి తీసుకురావడానికి TIFF (ట్యాగ్ చేయబడిన ఇమేజ్ ఫైల్ ఫార్మాట్) చిత్రాలపై ఆధారపడుతుంది.

Image

(ఎ-సి) (ఎ) కృత్రిమంగా సృష్టించిన 3 డి ఆబ్జెక్ట్, (బి) జియువి మరియు (సి) ఈస్ట్ సెల్ యొక్క మొగ్గ మచ్చల యొక్క పూర్తి ఉపరితల తీవ్రత సమాచారాన్ని చూపించే ఇమేజ్ స్టాక్‌ల నుండి మ్యాప్ అంచనాలు (కుడి) . ఆకృతి-ఆధారిత వాల్యూమ్ రెండరింగ్ యొక్క ముందు వీక్షణలు సూచన (ఎడమ) గా చూపబడతాయి. (d, e) ఆకారపు డిస్క్రిప్టర్‌గా ఈక్వర్‌ట్రాంగులర్ మ్యాప్ ప్రొజెక్షన్. (d) NRK సెల్‌లోని CD3δ-GFP ER సిగ్నల్ యొక్క వాల్యూమ్ రెండరింగ్ యొక్క పార్శ్వ XZ (పై వరుస) మరియు అక్షసంబంధ XY (దిగువ వరుస) వీక్షణలు. న్యూక్లియస్ ఆకారాన్ని పూర్తి (పై వరుస) లేదా సగం (దిగువ వరుస) లో వెల్లడించడానికి మధ్య నిలువు విభాగానికి పైన ఉన్న అన్ని ER సిగ్నల్ (dI లో చూపిన ఎరుపు పొర) ఇమేజ్ ప్రాసెసింగ్ ద్వారా తొలగించబడింది. మ్యాప్ ప్రొజెక్షన్ కోసం ఎలివేషన్ రిఫరెన్స్‌గా ఒక సూచన ఎలిప్సోయిడ్ (d.III, d.VII) కేంద్రకంపై అంచనా వేయబడింది. (ఇ) (d.II-d.VIII) లో చూపిన కేంద్రకం యొక్క మొత్తం ఉపరితలం కోసం ఎత్తు మ్యాప్‌గా మ్యాప్ ప్రొజెక్షన్. రంగు-కోడింగ్ (ఎఫ్) ద్వారా ప్రోట్రూషన్స్ మరియు ఇండెంటేషన్ల రూపంలో సూచన నుండి వ్యత్యాసాలు ఖచ్చితంగా ప్రదర్శించబడతాయి. చూపిన అన్ని అంచనాలు ఈక్విట్రాంగ్యులర్ మ్యాప్స్, పిక్సెల్-ఇంటర్పోలేటెడ్ (సి, ఇ) గా ప్రదర్శించబడతాయి లేదా (ఎ, బి) కాదు . స్కేల్ బార్లు, 5 μm (బి, సి), 10 μm (డి) .

పూర్తి పరిమాణ చిత్రం

మ్యాప్ అంచనాల యొక్క మొదటి మూల్యాంకనం కోసం, రేఖాగణిత నమూనాలను కలిగి ఉన్న ఉపరితల వస్తువులతో కృత్రిమంగా సృష్టించిన చిత్ర స్టాక్‌లను ఉపయోగించాలని మేము నిర్ణయించుకున్నాము. ఫ్లోరోసెన్స్ మైక్రోగ్రాఫ్‌లకు విరుద్ధంగా, కృత్రిమ చిత్రాలు గోళాకార ఉల్లంఘనలు మరియు విక్షేపం వంటి ఆప్టికల్ పరిమితులతో బాధపడవు. 2D మ్యాప్ అంచనాలపై ఖచ్చితమైన మరియు వివరణాత్మక ప్రదర్శన ఈ నమూనాలతో పరీక్షించబడి ధృవీకరించబడుతుంది (Fig. 2a మరియు అనుబంధ Fig. 1f). మొత్తం ఉపరితల కంటెంట్ పూర్తిగా అంచనా వేయబడింది మరియు రేఖాగణిత నమూనాలు ఖచ్చితంగా పునరుత్పత్తి చేయబడ్డాయి.

ప్రత్యేకమైన శాస్త్రీయ ఆసక్తి ఉన్న నమూనాలను 2D మ్యాప్ అంచనాలకు ప్రత్యేకంగా సరిపోతుందని మేము భావించాము. ఉదాహరణగా మేము జెయింట్ యూనిలామెల్లార్ వెసికిల్స్ (జియువి) ను ఎంచుకున్నాము, వీటిని సాధారణంగా దశల విభజన మరియు లిపిడ్ తెప్పలు 3 ను దృశ్యమానం చేయడానికి ఉపయోగిస్తారు. మేము రెండు ఫ్లోరోసెంట్‌గా లేబుల్ చేయబడిన లిపిడ్‌లతో కూడిన GUV యొక్క కన్ఫోకల్ చిత్రాలను తీసుకున్నాము మరియు Map3-2D తో మ్యాప్ అంచనాలను సృష్టించాము. మళ్ళీ, GUV యొక్క పూర్తి ఉపరితల సమాచారం నిర్మాణాత్మకంగా అనుసంధానించబడిన చిత్రంగా ప్రదర్శించబడుతుంది (Fig. 2b). గమనించదగినది, ఫలిత 2D మ్యాప్ ఎలా ప్రదర్శించబడుతుందో వినియోగదారు స్వేచ్ఛగా ఎంచుకోవచ్చు. మ్యాప్ 3-2 డి ఉపరితల సమాచార కంటెంట్ X, Y లేదా Z- అక్షం వెంట విప్పుతుందా లేదా మ్యాప్ చిత్రాలు పిక్సెల్-ఇంటర్పోలేటెడ్ లేదా ప్రదర్శించబడుతున్నాయా అనే దానిపై ఆధారపడి వివిధ అంచనాలను అందిస్తుంది (అనుబంధ Fig. 2 మరియు 3). మ్యాప్ 3-2 డి ప్రస్తుతం విభిన్న డేటా సెట్ల (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్ 4 మరియు సప్లిమెంటరీ టేబుల్ 1 విభిన్న అంచనాల లక్షణాల సారాంశం కోసం).

జీవ నమూనాగా మేము S. సెరెవిసియా మొగ్గ మచ్చలను ఎంచుకున్నాము. ఇవి ఈస్ట్ కణాలు 5 యొక్క కణ విభజనల ఫలితంగా కణ గోడపై చిటిన్ నిక్షేపాలు. మునుపటి ఉదాహరణల మాదిరిగా కాకుండా, మొగ్గ మచ్చ సంకేతాలు మొత్తం ఉపరితలాన్ని పూర్తిగా కవర్ చేయలేదు. బదులుగా, మచ్చలు సెల్ గోడకు భిన్నమైన రింగ్ లాంటి నిర్మాణాలు, వాటి మధ్య సిగ్నల్ లేని ప్రాంతాలు ఉంటాయి. సాంప్రదాయిక ప్రదర్శన పద్ధతి ద్వారా ప్రతి వ్యక్తి మచ్చను మరియు దాని పంపిణీని ఒకే పరిమాణ చిత్రంలో ప్రదర్శించడం చాలా అరుదుగా ఉన్నందున, మ్యాప్ 3-2 డి సాఫ్ట్‌వేర్ అటువంటి సమాచారాన్ని ఒకే 2 డి మ్యాప్‌లో అందించగలదా అని మేము పరీక్షించాము. మేము వైడ్‌ఫీల్డ్ మైక్రోస్కోప్‌లో ఫ్లోరోసెంట్‌గా లేబుల్ చేయబడిన గోధుమ జెర్మ్ అగ్లుటినిన్-చికిత్స చేసిన ఈస్ట్ కణాల Z- స్టాక్‌లను కొనుగోలు చేసాము మరియు చిత్రాలను సాఫ్ట్‌వేర్‌కు లోబడి ఉంచాము. ఫలిత 2D మ్యాప్ ప్రొజెక్షన్ మొత్తం సంఖ్య మరియు అన్ని మొగ్గ మచ్చల పంపిణీ రెండింటినీ ఒక పరస్పర అనుసంధాన చిత్రంలో స్పష్టంగా చూపించింది (Fig. 2c).

జీవసంబంధమైన నమూనాలలో ఎక్కువ భాగం మృదువైన ఉపరితల ఆకృతులను కలిగి లేనందున, 2D మ్యాప్‌లో మెమ్బ్రేన్ అన్‌డ్యులేషన్‌ను ప్రదర్శించడానికి మేము పరిష్కారాల కోసం చూశాము. మ్యాప్ అంచనాల తరం 3 డి ఉపరితల డేటాను 2 డి మ్యాప్‌లలోకి తెరవడానికి రిఫరెన్స్ ఎలిప్‌సోయిడ్‌లపై ఆధారపడుతుంది (అనుబంధ పద్ధతుల్లో మరింత వివరించబడింది). తీవ్రత విలువ అంచనాలతో పాటు (Fig. 2a-c లో చూపిన విధంగా), ఎలిప్సోయిడ్‌ను ఎలివేషన్ రిఫరెన్స్‌గా (అంటే బేస్‌లైన్) ఉపయోగించడం ద్వారా ఉపరితల ఎత్తు పంపిణీని అంచనా వేసే అవకాశాన్ని కూడా ఇది అందిస్తుంది. కార్టోగ్రాఫికల్ సందర్భంలో చెప్పాలంటే, రిఫరెన్స్ ఎలిప్సోయిడ్‌ను భౌగోళిక సగటు సముద్ర మట్టంతో పోల్చవచ్చు మరియు వస్తువు యొక్క ఉపరితలం దానిపై (క్రింద, పైన లేదా క్రింద) (సానుకూల, సున్నా లేదా ప్రతికూల) ఎత్తును సూచిస్తుంది. కార్టోగ్రాఫిక్ మ్యాప్‌లలోని హైప్సోమెట్రిక్ టింట్‌ల మాదిరిగానే, ఉపరితలం మరియు దాని రిఫరెన్స్ ఎలిప్సోయిడ్ మధ్య ఎత్తు వ్యత్యాసాలను అంచనా వేయవచ్చు మరియు బేస్లైన్ (ప్రోట్రూషన్స్ మరియు ఇండెంటేషన్స్) నుండి విచలనాన్ని సూచించడానికి రంగు-కోడెడ్ చేయవచ్చు. రిఫరెన్స్ ఎలిప్సోయిడ్కు సంబంధించి ఉపరితల ఆకారాన్ని మరియు కాలక్రమేణా ఆకారం యొక్క మార్పును వివరించడానికి రంగు-కోడింగ్ ఉపయోగించవచ్చు. ఎలిప్సోయిడ్ కాని అసమాన ఉపరితలాలకు ఉదాహరణగా మేము క్షీరద కణం యొక్క బయటి అణు పొరను ఎంచుకున్నాము. ఇది ఎండోప్లాస్మిక్ రెటిక్యులం (ER) తో పరస్పరం ఉన్నందున, మేము ER ట్రాన్స్‌మెంబ్రేన్ ప్రోటీన్ CD3δ-GFP 6 ను వ్యక్తీకరించే NRK కణాల కన్ఫోకల్ Z- స్టాక్‌లను తీసుకున్నాము, ఇమేజ్ ప్రాసెసింగ్ ద్వారా అణు ఉపరితల సిగ్నల్‌ను సంగ్రహించి, ఇమేజ్ సిరీస్‌ను మ్యాప్ 3-2D సాఫ్ట్‌వేర్‌కు లోబడి ఉంచాము. (Fig. 2d). ఫలిత ప్రొజెక్షన్ అణు ఉపరితలం యొక్క సంబంధిత ఎత్తు మ్యాప్‌ను చూపించింది, ప్రోట్రూషన్ (పాజిటివ్ ఎలివేషన్) మరియు ఇండెంటేషన్ (నెగటివ్ ఎలివేషన్) ప్రాంతాలను ప్రదర్శించడానికి రంగు-కోడెడ్. కాలక్రమేణా అణు ఆకారం యొక్క మార్పులను వేర్వేరు సమయ బిందువులలో తీసిన ఇమేజ్ స్టాక్‌ల నుండి 2 డి మ్యాప్ అంచనాలను విశ్లేషించడం ద్వారా పరిశీలించవచ్చు మరియు అంచనా వేయవచ్చు (అనుబంధ వీడియోలు 1–3).

జీవ నమూనాల డైనమిక్ విశ్లేషణల కోసం మ్యాప్ అంచనాల వినియోగాన్ని మరింత అన్వేషించడానికి మేము 4D ఇమేజ్ స్టాక్‌లను (అంటే కాలక్రమేణా 3D ఇమేజింగ్) మ్యాప్ 3-2 డి సాఫ్ట్‌వేర్‌కు గురిచేసాము. అటువంటి ప్రయోగాలతో పరిమితం చేసే ఏకైక అంశం ఒకే పొరకు బదులుగా మొత్తం ఇమేజ్ స్టాక్‌ను పొందటానికి అవసరమైన అదనపు సమయం. అయినప్పటికీ, అధిక మిల్లీసెకన్లలో తక్కువ సెకన్ల పరిధి 7, 8 వరకు ప్రోటీన్ల యొక్క అనేక వ్యాప్తి రేట్లు (జిఎఫ్‌పి చిమెరాస్‌తో సహా) తగినంతగా విశ్లేషించబడతాయి కాబట్టి, చాలా మోటరైజ్డ్ వైడ్‌ఫీల్డ్ సెటప్‌లు మరియు అనేక కాన్ఫోకల్ మైక్రోస్కోప్‌లు (ఉదాహరణకు స్పిన్నింగ్ డిస్క్ మైక్రోస్కోప్‌లు, లైకా యొక్క ప్రతిధ్వనించే స్కానర్, జీస్ లైవ్ ) అటువంటి అధిక డేటా సేకరణ రేట్లను అనుమతిస్తుంది. మ్యాప్ 3-2 డి ముగుస్తున్న దానితో కలిపి సింగిల్ ఫ్రేమ్‌లపై ఇమేజ్ స్టాక్‌ల యొక్క ప్రయోజనం ఏమిటంటే, మొత్తం ఉపరితల డేటా కంటెంట్‌ను ఒకే మ్యాప్ ప్రొజెక్షన్ ఇమేజ్‌పై దృశ్యమానం చేయవచ్చు మరియు తనిఖీ చేయవచ్చు. ఈ విధంగా, సాంప్రదాయిక 2 డి టైమ్-లాప్స్ ఇమేజింగ్ ప్రయోగాలలో చేసినట్లుగా, జీవసంబంధమైన సిగ్నల్ లేదా ఆసక్తి యొక్క నిర్మాణం ఎప్పటికీ కోల్పోదు మరియు అందువల్ల ఇమేజ్ విశ్లేషణ నుండి తొలగించబడదు. అలాగే, ఏదైనా తీవ్రత విలువ-ఆధారిత చిత్ర విశ్లేషణ మరింత పూర్తి అవుతుంది, అందువల్ల మ్యాప్ 3-2 డి సాఫ్ట్‌వేర్‌తో మరింత ఖచ్చితమైనది, ఎందుకంటే మూల్యాంకనం ఒకే పొర నుండి ఉప-కంటెంట్‌కు బదులుగా మొత్తం ఉపరితల డేటాపై ఆధారపడి ఉంటుంది. మ్యాప్ 3-2 డి యొక్క మ్యాప్ అంచనాలు అసలు డేటాతో క్రాస్ రిఫరెన్స్ మరియు దీనికి విరుద్ధంగా, ఆసక్తి ఉన్న ప్రాంతాలను (ROI లు) మ్యాప్ ప్రొజెక్షన్ ఇమేజ్‌లో సౌకర్యవంతంగా ఎంచుకోవచ్చు. ముడి డేటా ఇమేజ్ స్టాక్ (Fig. 1) లోని సంబంధిత ప్రాంతం నుండి చిత్రాలు ఖచ్చితంగా విశ్లేషించబడతాయి.

ఫోటోయాక్టివేషన్ 9 (Fig. 3 మరియు సప్లిమెంటరీ Fig. 5 మరియు సప్లిమెంటరీ వీడియో 4), ఫోటోబ్లిచింగ్ (FLIP) (సప్లిమెంటరీ వీడియో 5) లో ఫ్లోరోసెన్స్ నష్టం మరియు ఫోటోబ్లిచింగ్ (FRAP) 7 నుండి ఫ్లోరోసెన్స్ రికవరీ నుండి ప్రోటీన్ డైనమిక్స్ను విశ్లేషించడానికి మేము Map3-2D సాఫ్ట్‌వేర్‌ను పరీక్షించాము. (అనుబంధ Fig. 6) క్షీరద మరియు ఈస్ట్ కణాలలో ప్రయోగాలు. ఫోటోయాక్టివేషన్ కోసం, CD3δ-PAmCherry 6 యొక్క ER సిగ్నల్ స్థానికంగా N2a కణాల వెనుక-పార్శ్వ వైపు ఎరుపు ఫ్లోరోసెన్స్ 10 కు మార్చబడింది. ప్రతిధ్వనించే స్కానర్‌ను ఉపయోగించి కన్ఫోకల్ మైక్రోస్కోపీ ద్వారా ER అంతటా దాని విస్తరణ కాలక్రమేణా రికార్డ్ చేయబడింది మరియు 4D ఇమేజ్ స్టాక్‌లు మ్యాప్ 3-2 డి సాఫ్ట్‌వేర్‌కు లోబడి ఉన్నాయి (Fig. 3a). ఇక్కడ, మొత్తం CD3δ-PAmCherry ER సిగ్నల్ కేంద్రకం (Fig. 3b) చుట్టూ విప్పబడే భిన్నమైన ఉపరితలంగా పరిగణించబడింది. వేర్వేరు సమయ బిందువులలో (Fig. 3 సి) మ్యాప్ ప్రొజెక్షన్లపై ప్లాట్ ప్రొఫైలింగ్ ద్వారా పూర్తి మధ్య-క్షితిజ సమాంతర ఉపరితల విభాగంలో CD3δ-PAmCherry యొక్క విస్తరణను మేము కొలిచాము. సాంప్రదాయిక ప్రదర్శన పద్ధతులను ఉపయోగించడం ద్వారా ఈ రకమైన 3D విశ్లేషణ సాధించడం కష్టం. అయితే, మ్యాప్ ప్రొజెక్షన్లు మరియు మ్యాప్ 3-2 డిని ఉపయోగించడం ద్వారా ఇది సూటిగా ఉంటుంది. మేము కాలక్రమేణా ER యొక్క వివిధ ROI ల కోసం సగటు తీవ్రతలను కూడా కొలిచాము (Fig. 3a, d). మ్యాప్ అంచనాలు ప్రతిసారీ పాయింట్ వద్ద ER ఉపరితలం యొక్క నిర్మాణాత్మకంగా అనుసంధానించబడిన చిత్రాలను అందించినందున, ROI లను సులభంగా ఎంచుకోవచ్చు మరియు విశ్లేషించవచ్చు. సింగిల్ Z- లేయర్ చిత్రాల సాంప్రదాయిక తీవ్రత కొలతలతో పోలిస్తే, మ్యాప్ అంచనాల నుండి వచ్చిన విశ్లేషణ కాలక్రమేణా చాలా సున్నితమైన తీవ్రత పంపిణీని చూపించింది (Fig. 3a, d, మొత్తం ఉపరితలం మరియు ఒకే Z- పొర కోసం వక్రతలను పోల్చండి). ఉపరితల కొలత పూర్తి డేటా కంటెంట్ మీద ఆధారపడి ఉంటుంది కాబట్టి, వ్యక్తిగత Z- పొరల మధ్య వ్యత్యాసాలు విశ్లేషణ యొక్క మొత్తం ఫలితాన్ని ప్రభావితం చేయలేదు (అనుబంధ Fig. 5).

Image

(ఎ) CD3δ-PAmCherry ని వ్యక్తీకరించే N2a సెల్ యొక్క ఫోటోయాక్టివేషన్ ప్రయోగం, ఒకే Z- పొర (ఎడమ) లేదా మోల్‌వైడ్ మ్యాప్ ప్రొజెక్షన్ (కుడి) గా ప్రదర్శించబడుతుంది . సెల్ యొక్క వెనుక-పార్శ్వ వైపు మొదటి ఫోటోయాక్టివేషన్ సంఘటన జరిగిన వెంటనే 0 సెకన్ల నుండి నిరంతర ఫోటోయాక్టివేషన్ మీద వేర్వేరు సమయ పాయింట్లు చూపబడతాయి. ఫ్లోరోసెన్స్ సిగ్నల్ ప్లాట్ ప్రొఫైలింగ్ (సి) మరియు సగటు తీవ్రత ప్రాంత కొలతలు (డి) కోసం ఉపయోగించే (తెలుపు చుక్కల) పంక్తి మరియు (ఎరుపు, ఆకుపచ్చ మరియు నీలం) ప్రాంత ఎంపికలు టైమ్ పాయింట్ 124 సెకన్లలో మ్యాప్ ప్రొజెక్షన్‌లో ప్రదర్శించబడతాయి. ధోరణి కోసం, ఒక స్కీమాటిక్ మోల్‌వైడ్ ప్రొజెక్షన్ (బి) న్యూక్లియస్‌కు సంబంధించి ER సిగ్నల్ యొక్క స్థానాన్ని నాలుగు పార్శ్వ వైపులా (ఎడమ, కుడి, వెనుక, ముందు) మరియు ఎగువ మరియు దిగువ స్థానాలు (కేంద్రకం పైన మరియు క్రింద) చూపిస్తుంది. (సి) (ఎ) లో చూపిన మ్యాప్ అంచనాలపై ప్లాట్ ప్రొఫైలింగ్ ద్వారా ER యొక్క పూర్తి మధ్య-క్షితిజ సమాంతర విభాగంలో ఫోటోయాక్టివేటెడ్ CD3 CD-PAmCherry వ్యాప్తి యొక్క పరిమాణాత్మక డైనమిక్ విశ్లేషణ. (డి) కాలక్రమేణా వివిధ ROI లలో ఫోటోయాక్టివేటెడ్ CD3δ-PAmCherry యొక్క పరిమాణాత్మక విశ్లేషణ. సగటు తీవ్రత వక్రత యొక్క రంగులు (ఎ) లో చూపిన ఎంపికల కోసం ఉపయోగించే రంగులకు అనుగుణంగా ఉంటాయి. సంబంధిత మ్యాప్‌ల నుండి ప్రాంత సమాచారాన్ని క్రాస్-రిఫరెన్స్ చేయడం ద్వారా అసలు ఇమేజ్ స్టాక్‌లపై అన్ని సగటు తీవ్రతలను కొలుస్తారు. సింగిల్ Z- లేయర్ చిత్రాల కోసం, ఆ ఒకే పొర నుండి మొత్తం ER ప్రాంతం కొలతల కోసం ఉపయోగించబడింది. మోల్‌వైడ్ పటాలు పిక్సెల్-ఇంటర్‌పోలేటెడ్, గరిష్ట తీవ్రత అంచనాలుగా ప్రదర్శించబడతాయి. మెరుగైన తీవ్రత వివక్ష కోసం, ఇంద్రధనస్సు సున్నితమైన శోధన పట్టికను ఉపయోగించడం ద్వారా (ఎ) లోని అన్ని చిత్రాలు ప్రదర్శించబడతాయి. au, ఏకపక్ష యూనిట్లు. స్కేల్ బార్, 10 μm.

పూర్తి పరిమాణ చిత్రం

విస్తృత శ్రేణి జీవ నమూనాల కోసం మ్యాప్ అంచనాల ప్రయోజనాలను మేము ప్రదర్శించాము. మా సాఫ్ట్‌వేర్ యొక్క ముఖ్య ప్రయోజనం ఏమిటంటే, 3D మైక్రోగ్రాఫ్‌ల నుండి సంక్లిష్టమైన ఉపరితల డేటా ఒకే నిర్మాణాత్మకంగా అనుసంధానించబడిన ప్రొజెక్షన్ చిత్రంగా ప్రదర్శించబడుతుంది. ఈ చిత్రం మరియు అసలు ఇమేజ్ స్టాక్ మధ్య క్రాస్-రిఫరెన్సింగ్ ద్వారా, తీవ్రతలు మరియు ఆకృతుల యొక్క ఖచ్చితమైన పరిమాణాత్మక విశ్లేషణలను సులభంగా మరియు అకారణంగా అమలు చేయవచ్చు.

పద్ధతులు

చిత్ర ప్రాసెసింగ్ మరియు విశ్లేషణ

అన్ని కృత్రిమ చిత్ర స్టాక్‌లను సృష్టించడానికి స్వీయ-వ్రాసిన మాక్రోలు స్పియర్_బిల్డర్ మరియు ఎల్లిప్‌సోయిడ్_బిల్డర్ ఉపయోగించబడ్డాయి. మాక్రోలను //imagej.nih.gov/ij/macros/ వద్ద ఉచితంగా డౌన్‌లోడ్ చేసుకోవచ్చు. ఇమేజ్ స్టాక్స్ యొక్క ఆకృతి-ఆధారిత వాల్యూమ్ రెండరింగ్‌లు ఇమేజ్‌జే 3 డి వ్యూయర్ 11 తో రూపొందించబడ్డాయి . ఫోటోషాప్ (అడోబ్) మరియు ఇమేజ్‌జే / ఫిజి 12, 13 ఉపయోగించి సాధారణ ఇమేజ్ ప్రాసెసింగ్ మరియు ప్రచురణ కోసం తుది చిత్ర సన్నాహాలు జరిగాయి.

జెయింట్ యూనిలామెల్లార్ వెసికిల్స్ (జియువి) తయారీ

గతంలో 14 వివరించిన విధంగా జియువిలను తయారు చేశారు. సంక్షిప్తంగా, లిపిడ్ మిశ్రమాలను (అవంతి పోలార్ లిపిడ్స్, అలబామా, యుఎస్ఎ) 5 మి.గ్రా / మి.లీ వద్ద తయారు చేసి, ఏకరీతిగా కలిపి, ఇండియం-టిన్ ఆక్సైడ్ కప్పబడిన గ్లాస్ స్లైడ్స్ (డెల్టా టెక్నాలజీస్) పై సమానంగా వ్యాప్తి చేసి, కనీసం 2 గం వరకు వాక్యూమ్ కింద ఎండబెట్టి, ఉంచారు అనుకూలీకరించిన టెఫ్లాన్ చాంబర్‌లోకి, 2 మిమీ సన్నని స్పేసర్ ద్వారా వేరుచేయబడి, సుక్రోజ్ ద్రావణంతో (600 ఎమ్ఎమ్) నిండి ఉంటుంది. గతంలో వివరించిన GUV ఎలక్ట్రోఫార్మేషన్ ప్రోటోకాల్ 15 ను అనుసరించి 60 ° C వద్ద 2 h కోసం ఎలక్ట్రిక్ AC- ఫీల్డ్ (1.1 V, 10 Hz) వర్తించబడింది. లిపిడ్ మిశ్రమం: DPPC (53 mol%), DOPC (27 mol%), కొలెస్ట్రాల్ (20 mol%), NBD-DPhPE (0.5 mol%) మరియు లిసామైన్-రోడమైన్- PE (0.1 mol%). గది ఉష్ణోగ్రతకు చల్లబడిన తరువాత లిపోజోమ్‌లను పండించారు. 200 μl పరిశీలన గది (ల్యాబ్-టేక్ 8-బావి చాంబర్డ్ # 1.0 బోరోసిలికేట్ లేదా ఐబిడి 8-వెల్ μ స్లైడ్) 2 mg / ml BSA ను ఉపయోగించి పూతతో పూత పూయబడింది. సాంద్రతలో తేడాను పొందడానికి సుక్రోజ్ కలిగిన GUV లను 600 mM గ్లూకోజ్ బఫర్‌తో కలిపారు, ఇది స్థిరమైన మరియు ఫోకల్ ప్లేన్ స్థానికీకరించిన GUV లకు దగ్గరగా ఉండే ఇమేజింగ్‌ను అనుమతిస్తుంది. GUV లకు జోడించిన బఫర్ GUV ద్రావణం యొక్క ఓస్మోలారిటీకి సరిపోతుంది.

S. సెరెవిసియా మొగ్గ మచ్చల లేబులింగ్

ఈస్ట్ కణాలు రాత్రిపూట పెరిగాయి, సెంట్రిఫ్యూగేషన్ ద్వారా పండించబడ్డాయి మరియు పిబిఎస్‌లో తిరిగి ఇవ్వబడ్డాయి. 10 7 కణాల 500 μl ఆల్కాట్స్ పిబిఎస్‌లో రెండుసార్లు కడుగుతారు మరియు పిబిఎస్‌లోని ట్రిటియం వల్గారిస్ (సిగ్మా-ఆల్డ్రిచ్) నుండి 500 mg FITC- కంజుగేటెడ్ లెక్టిన్‌లో 1 mg ml −1 గా ration తతో లేబుల్ చేయబడ్డాయి. గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద కణాలు 30 నిమిషాలు శాంతముగా ఆందోళనకు గురయ్యాయి, సెంట్రిఫ్యూగేషన్ ద్వారా గుచ్చుతారు మరియు పిబిఎస్‌లో మూడుసార్లు కడుగుతారు. లేబుల్ చేయబడిన ఈస్ట్ కణాలు 100 μl PBS లో తిరిగి ఇవ్వబడ్డాయి మరియు ఇమేజింగ్ కోసం ప్రోలాంగ్ గోల్డ్ (లైఫ్ టెక్నాలజీస్) లో అమర్చబడ్డాయి.

DNA నిర్మిస్తుంది

ఎక్స్‌ప్రెషన్ వెక్టర్స్ పిసిడి 3δ-జిఎఫ్‌పి మరియు పిసిడి 3δ-పామ్‌చెర్రీల యొక్క ప్లాస్మిడ్ పివైఎఫ్‌పి-జిఎల్-జిపిఐ మరియు సిఎఫ్‌పి వెర్షన్, పిసిడి 3δ-సిఎఫ్‌పి గతంలో 6, 16 గా వివరించబడ్డాయి.

క్షీరద కణ బదిలీ

దుల్బెకో యొక్క సవరించిన ఈగిల్ మాధ్యమంలో NRK మరియు N2a కణాలు 5% (v / v) CO 2 లో 37 ° C వద్ద 10% (v / v) పిండం బోవిన్ సీరంతో భర్తీ చేయబడ్డాయి. 25 kDa లీనియర్ పాలిథిలినిమైన్ (పాలిసైన్సెస్) ఉపయోగించి తాత్కాలిక బదిలీలు జరిగాయి. 16-24 గం పోస్ట్ ట్రాన్స్ఫెక్షన్ కణాలు కాన్ఫోకల్ మైక్రోస్కోపీకి లోబడి ఉన్నాయి.

సూక్ష్మదర్శిని

GUV లు, ఈస్ట్ మరియు క్షీరద కణాల కాన్ఫోకల్ ఇమేజింగ్ ఒక ప్రతిధ్వని స్కానర్-అమర్చిన లైకా TCS SP5 తో HCX PL APO 63x / 1.20 న్యూమరికల్ ఎపర్చర్ (NA) వాటర్ ఆబ్జెక్టివ్ లెన్స్ (లైకా) మరియు 63x / 1.40 ఉపయోగించి ఒక జీస్ LSM 780 మైక్రోస్కోప్ ఉపయోగించి ప్రదర్శించబడింది. 1 మరియు 3 అవాస్తవిక యూనిట్ల మధ్య NA ప్లాన్-అపోక్రోమాట్ ఆయిల్ ఆబ్జెక్టివ్ లెన్స్ (జీస్) మరియు పిన్‌హోల్ సెట్టింగులు. 100x / 1.45 NA ప్లాన్-అపోక్రోమాట్ ఆయిల్ ఆబ్జెక్టివ్ లెన్స్ (ఒలింపస్) ను ఉపయోగించి ఒలింపస్ ఎక్స్‌లెన్స్ IX81 మైక్రోస్కోప్ సిస్టమ్‌తో ఈస్ట్ మొగ్గ మచ్చల యొక్క ఎపిఫ్లోరోసెన్స్ మైక్రోస్కోపీని ప్రదర్శించారు.

అదనపు సమాచారం

ఈ కథనాన్ని ఎలా ఉదహరించాలి : సెండ్రా, జిహెచ్ మరియు ఇతరులు. 3 డి ఫ్లోరోసెన్స్ మైక్రోగ్రాఫ్‌ల విజువలైజేషన్ మరియు పరిమాణాత్మక విశ్లేషణ కోసం 2 డి మ్యాప్ అంచనాలు. సైన్స్. ప్రతిని 5, 12457; doi: 10.1038 / srep12457 (2015).

చరిత్రను మార్చండి

అనుబంధ సమాచారం

PDF ఫైళ్లు

  1. 1.

    అనుబంధ సమాచారం

వీడియోలు

  1. 1.

    అనుబంధ వీడియో ఎస్ 1

  2. 2.

    అనుబంధ వీడియో ఎస్ 2

  3. 3.

    అనుబంధ వీడియో ఎస్ 3

  4. 4.

    అనుబంధ వీడియో ఎస్ 4

  5. 5.

    అనుబంధ వీడియో ఎస్ 5

వ్యాఖ్యలు

వ్యాఖ్యను సమర్పించడం ద్వారా మీరు మా నిబంధనలు మరియు సంఘ మార్గదర్శకాలకు కట్టుబడి ఉండాలని అంగీకరిస్తున్నారు. మీరు దుర్వినియోగమైనదాన్ని కనుగొంటే లేదా అది మా నిబంధనలు లేదా మార్గదర్శకాలకు అనుగుణంగా లేనట్లయితే దయచేసి దాన్ని అనుచితమైనదిగా ఫ్లాగ్ చేయండి.